Изучение митоза Checkpoint, иллюстрируя динамического поведения белков кинетохора и хромосомы движения в живых<em> Drosophila</em> Синцитиальный эмбрионов

1. Трансгенные мухи и обслуживание Трансгенных мух, используемые в этой демонстрации: Ubq-GFP-Cdc20 (II), Ubq-ЗП-His2B (X *); Ubq-GFP-Cdc20 (II *), Ubq-GFP-Cdc20 (II *); mad2 Е.Ю. ( III *) и Ubq-GFP-Cdc20 трансгенных мух ранее созданный в лаборатории с помощью стандартного Р-элемент опосредованного трансгенный подход 10,11 и Ubq-ЗП-His2B это своего рода подарок от Yohanns Belaïche в UMR 144 CNRS / Институт Кюри, Париж, Франция. Они были введены в Mad2 мутант фона с помощью стандартных дрозофилы генетики. Mad2 EY оригинальных мутантов линии было закуплено в Блумингтон фондового центра. Мы не будем обсуждать процедура, используемая для повышения трансформантов в этом протоколе. Примечание: * представляет собой число хромосом. Обслуживание: трансгенные мухи были сохранены при 25 ° C в пластиковых флаконах containinг летать питания и дополнительные сухой порошок дрожжи на вершине. Флакон был регулярно менять каждые 3-4 недели в зависимости от условий выращивания (рис. 1). 2. Лети приготовления пищи (Лаборатория шкале) Соответствующее количество лету смесь еда нагревается при постоянном помешивании до растворения компонентов. О 8-10 мл этой среде был распространен в качестве раствора в каждый пластиковый флакон (диаметром 2,5 см х 8 см длиной) с помощью Jencons научно ООО перистальтического насоса. Когда пища суспензия была создана и охлаждают до комнатной температуры, затем флакон подключен с вилкой пена хлопка. Эти продукты флаконы помещаются в лоток, который затем запечатанный в полиэтиленовый пакет и хранить при температуре 4 ° C для дальнейшего использования. 3. Мелкое яйцо коллекции Около 50 пар 2-3 дня по старой мухи взрослых были переведены в новый флакон пищу муха снабжена дополнительными сухой порошок дрожжей на поверхности при температуре 25 ° C для мирянв G эмбрионы. Мух, которые затем передаются новому флакон каждый час и оставить эмбрионов во флаконе в течение 30 минут, чтобы некоторые из собранных эмбрионы в возрасте 8-10 вокруг ядерной цикл разделения, когда ядра постепенно переходят на кору и организован монослоя. Первая коллекция часов обычно уничтожается, как это часто содержит возраста эмбрионов, которые были сохранены в женских тел, когда условия не подходят для укладки. 4. Подготовка Покровные и слайды Возьмите 50 х 22 мм, покровного и слегка смочите ее четырех углов с одной стороны, с очень небольшим количеством воды с помощью влажной мягкой щеткой ручку и положил его на предметное стекло так, чтобы покровное не двигается из-за капиллярного поверхностного натяжения вызваны тонкой жидкой пленки. Нанесите тонкую полоску гептан клея посередине покровного стекла, гептан должна испариться за несколько секунд, чтобы оставить клей на покровное. Вырезать другой покровное с алмазным пером на небольшие квадраты (~ 1,5 мм 2), выбрать один и разместить его на одном конце полосы клея (это используется для открытия иглы при микроинъекции требуется) и сохранить для будущих другие использовать. Возьмем другой предметное стекло и наклеить кусочек двусторонней клейкой ленты длиной около 2 см к нему и снимите крышку бумаги. (См. Рисунок 2А и В). 5. Dechorionate эмбрионов Передача мухи на свежий флакон пищи и использовать смоченные тонкой кистью пера передать около 50 яиц на двустороннюю липкую ленту на слайд с соответствующим количеством жидкости, чтобы яйца должны быть распространено. Когда жидкость испарится яйца прилипают к ленте. При вскрытии микроскоп сенсорным яйца несколько раз вдоль длинной оси использованием внешней стороне половину пинцетом осторожно до хориона нарушается и открытым, но оставить эмбриона в хорионной оболочки, чтобы предотвратить быстрое обезвоживание. Продолжайте этот процесс до 10-20 яиц была обработана (в зависимости от числа яиц, необходимых для одного эксперимента). Эмбрионы могут быть подобраны и удаляется из корпуса и хорион осторожно положил на клей полосы одну за другой. Яйца могут быть размещены и приведены в соответствие либо с длинной стороной параллельно эмбриона или анти-параллельно длинной стороне полосы клея зависит от того, если они будут microinjected. Эмбрионы могут быть либо покрыты сразу с соответствующим количеством масла Voltalef 10S (5:1 смесь Holocarbon 700 нефтяных и 27 нефть, Sigma), чтобы предотвратить дальнейшее усыхание для немедленного изображений или помещают в камеру высыхания в течение 3-8 минут обезвоживает их дальше в зависимости от влажности помещения и цель эксперимента. Обезвоженный эмбрионов должна быть покрыта маслом 10S в случае необходимости, чтобы предотвратить чрезмерное обезвоживание, если микроинъекции не требуется. (См. Рис. 2С, D& E). 6. Изображения эмбрионов Покадровый или одного изображения живых эмбрионов собранные с помощью Leica TCS SP2 перевернутой конфокальной микроскопии с системой HCX PL APO CS 40X 1,25 иммерсионным цель (60 или 100X целей может быть использована также в зависимости от цели эксперимента, тем выше Увеличение использовали еще фото отбеливание будет происходить). Когда несколько изображений флуорофоров, которые перекрытия спектров и совместно выражается в тех же эмбрионов, каждый флуоресцентный белок длиной волны излучения была собрана последовательно. Возбуждения и излучения волн доступных в системе Leica TCS SP2 являются: GFP, λ Ex: 488 нм и λ Em: 500-600 нм. ППП, λ Ex: 543 нм и λ Em: 555-700 нм. Одно изображение часто получается как в среднем на 2 растровые строки в среднем по 2 кадра-сканирование. Это займет минимум 6,3 секунд для сканирования 512×512 рixel изображение в режиме одновременного сканирования и 15,44 секунды последовательном режиме сканирования и производит хорошее отношение сигнал-шум. Это время необходимо учитывать при создании временных рамок для покадровой изображение коллекционирования. Отверстие было обычно устанавливается в 1-2 а.е. (воздушные единицы), а мощность лазера доводят до максимально низкого уровня, чтобы избежать любого значительного фотообесцвечивания. 7. Спровоцировать SAC по Microinjecting Эмбрионы с соответствующими реагентами Подготовка иглы до начала эксперимента. Мы предпочитаем, чтобы вытащить иглу из силиконизированная стеклянных капилляров (GC-100-10, Гарвард), используя пламенный / коричневый микропипетки съемник (Саттер инструмент, модель: Р-97) с параметрами: тепло = 600, вытащить = 90, Vel = 70 , Дель = 150. Засыпки иглу с 1-2 мл соответствующей концентрации реагента в инъекции буфера с помощью тонкого кончика загрузкой (20 мкл много Эппендорф: W215818J). Установите иглу в иглу хоlder на микроскопе с давлением труба, связанных с управлением системой впрыска Эппендорф. Найти эмбриона в 40х цель и найти иголку тень без изменения фокальной плоскости путем перемещения иглы в центр поля зрения и постепенно снижая его вправо фокальной плоскости. Перемещение эмбрион от нежно, чтобы найти небольшую площадь нарушенных покровное предварительно установлен на одном из концов полосы клея. Очень осторожно двигаться кончик иглы, пока не достигнет края небольшой площади покровного и аккуратно разбивает его открыть. Перемещение эмбрионов обратно в поле зрения и выбрать эмбрион подходящего возраста для инъекций. Я обычно вводят эмбриона на ядерном цикле разделения на 5-7, как это до ядра мигрируют наружу в кору головного мозга. Ядерные этапах цикла разделение может быть определена быстрого сканирования флуоресцентных сигналов GFP-Cdc20 или сигнал ядерной ППП-гистонов 2B перед инъекцией 9. Тщательно перемещать Эмбрио близких к игле и скорректировать в фокальной плоскости и для эмбриона и иглы. Перемещение эмбриона в иглу и вводят капли реагента в нужное положение и двигаться от эмбриона (или следуйте инструкциям по микроинъекции системы). Эмбрион может быть введен с его задней или боковой в зависимости от цели эксперимента. После инъекции эмбрион готовы быть отображены в соответствующее время. (См. рис 2F & G) 8. Представитель Результаты Рисунок 1. Необходимые материалы:. штраф кисть, б. небольшой площади разбитого стекла контейнера, с. 22 х 50 мм, покровного, г. предметное стекло микроскопа, электронного. двусторонняя клейкая лента, ф. сухой порошок дрожжей в пробирку с отверстиями в крышке, г. дрожжигранулы для мух обслуживания, час. летать еда флаконе, я. половина пинцет для dechorionate эмбрионов, у. пару пинцет, к. гептан клей жидкости контейнер (мерную колбу). Рисунок 2. Диаграммы показывают подготовки покровные и слайды в шаге 4, эмбрион dechorionation в шаге 5 и иглы подготовки к микроинъекции в шаге 7. . Верхняя картинка показывает, покровное с полосой гептан клей по всей средней и небольшой площади сломанной покровное застряли на одном конце. В итоге картина показывает стекле тонким слоем воды при ее четырех углов провести покровное. Причина для использования слайд провести покровное это держать примерно на том же расстоянии, как найти, когда у вас двухсторонний скотч на слайдах, и таким образом избежать переориентации микроскоп во время арэлектронной рассечения и передачи эмбрионов между лентой и покровное. B. Слайд с короткой длиной двусторонний скотч применяется до отшелушивающим обложке бумага, используемая для dechorionating эмбриона. C. На рисунке слева показан эмбрионы с неповрежденной оболочек хориона с выраженным передним и задним концами, картинка справа показывает эмбрионов в разбитая скорлупа хориона, прежде чем они были переведены на покровное с клеем полосы D и E диаграммы, показывающие два.. пути передачи, размещения и согласования dechorionated эмбрионов на клей полосы. Эмбрионы были покрыты маслом 10S после соответствующего периода высыхания. F и G. диаграммы, показывающий, как открыть кончик иглы и позиции, таким образом, чтобы инъекцию. Одно-или замедленной изображений, полученных из описанных выше экспериментов может быть непосредственно анализировали с помощью программного обеспечения Leica или сохраняются в формате. TIF файлов, открытых лРМАТ для дальнейшего количественного анализа и редактирования с помощью других общий анализ изображения программ, таких как изображения J, Photoshop и т.д. метаморфизма два примера для иллюстрации этого приведены ниже: Пример 1: временной промежуток фильма (рис. 3) показывает, динамический набор кинетохора из GFP-Cdc20 и хромосомные движения в живых дрозофил синцитиальный эмбрионов. Область интересов от оригинального покадровой последовательности изображений было определено / Под ред-и автоматизированных партия преобразуется с помощью Photoshop программного обеспечения. Фильм был собран с использованием QuickTime программного обеспечения. Рисунок 3. Покадровой фильм показывает динамический набор кинетохора из GFP-Cdc20 и хромосомные движения в живых дрозофил синцитиальный эмбрионов. (A) Покадровый изображения были взяты из трансгенных эмбрионов синцитиальный совместного выражения GFP-Cdc20 (зеленый цвет)и RFP-гистонов 2B (в красном) белков слияния и были записаны с помощью Leica TCS SP2 конфокальной системе при 18 ° С при ядерных циклов деление 7-8. Кадры были сделаны каждые 10 секунд. Кадр с клетками уже в профазе рассматривается как нулевой момент времени 10. Щелкните здесь для просмотра фильмов на 3А . (B) GFP-Cdc20 можно легко наблюдать на профазы и прометафазе кинетохоры (B3 и 4, белые стрелки) и сохраняется на метафазе и анафазе кинетохоры (B5 и 6, белые стрелки). GFP-Cdc20 исключен из интерфазных ядер (белая стрелка), входящих в ядро ​​в начале профазы. Хроматина морфологии определяли с помощью со-выраженный His2BmRFP в качестве маркеров (B8-14). Бары = 5мм. Пример 2: SAC функции могут быть изучены с помощью манипулирования эмбрионов microinjecting антител, флуоресцентно меченых белков или Chemicaл соединений, представляющих интерес, который потенциально вызвать SAC. Например инъекционных колхицин в деполимеризоваться микротрубочек чтобы спровоцировать SAC, как показано на рисунке 4, 10. Рисунок 4. Mad2 имеет важное значение для колхицина, вызванной функции SAC 10. GFP-cdc20; mad2 + / +, GFP-cdc20; mad2 Е.Ю. (mad2 – / – нулевой мутанта) и GFP-mad2; mad2 эмбрионов EY лечили колхицин методом микроинъекции. Покадровый конфокальной снимки были сделаны до (01, 07 и 13) или после введения (02-06, верхние панели, 08-12, средние панели, 14-18, нижняя панель). GFP-Cdc20 (высшего и среднего панели) или GFP-Mad2 (нижняя панель) кинетохора сигналы были использованы в качестве клеточных маркеров прогрессии цикла. Верхняя панель, стрелки указывают арестован кинетохоры в 02-06. Области отмечен стрелкой в ​​01 указывает, что до колхицина, GFP-CDC20 исключен из ядра конце интерфазы. Средние панели, в отсутствие эндогенного Mad2, GFP-Cdc20 сигналы продолжают колебаться в и из ядра, и на и от кинетохоры, хотя цитокинеза оказывается дефектной, как и следовало ожидать в отсутствие эмбрионов микротрубочки, в присутствии колхицина (указано стрелками на 07-12), что свидетельствует о не удалось SAC функции арест клеток в ответ на прием колхицина. Разделение дочернего ядра не удалось в картине 10. Нижняя панель, наконечники стрел в 14-18 показывают арестован кинетохоры с накопленными GFP-Mad2 белков слияния, чтобы предложить функциональные GFP-Mad2 в спасательных фенотип SAC дефект мутант Mad2 эмбриона. Arrowhead в 13 указывает GFP-Mad2 накоплением в ядре конце интерфазы. Бар = 5мм. Эмбрионы microinjected с ~ 1% яичного объем 100мг/мл маточного раствора колхицина в 1 х PBS.