Diffusione laterale e esocitosi delle proteine di membrana in neuroni in coltura valutata utilizzando Recovery fluorescenza e fluorescenza-loss photobleaching
Summary
Questo rapporto descrive l'uso di imaging cellulare dal vivo e le tecniche di fotosbiancante per determinare l'espressione di superficie, vie di trasporto e la cinetica di traffico esogeno espresso, sensibile al pH GFP-tagged proteine a livello della membrana plasmatica dei neuroni.
Abstract
<p class="jove_content"> Proteine di membrana, quali recettori e canali ionici subiscono traffico attivo nei neuroni, che sono altamente polarizzato e morfologicamente complesso. Il traffico diretto è di fondamentale importanza per fornire, mantenere o eliminare le proteine sinaptiche.</p><p class="jove_content"> Super-dell'eclittica pHluorin (SEP) è un pH-sensibile al derivato di eGFP che è stato ampiamente utilizzato per l'imaging cellulare dal vivo di proteine di membrana plasmatica<sup> 1-2</sup>. A pH basso, protonazione di SEP diminuisce l'assorbimento di fotoni ed elimina emissione di fluorescenza. Come eventi di traffico più intracellulari si verificano in scompartimenti con pH basso, dove viene eclissato settembre fluorescenza, il segnale di fluorescenza dal set-tag proteine è prevalentemente dalla membrana plasmatica, dove è esposto il settembre ad un ambiente extracellulare pH neutro. Quando viene illuminato a settembre ad alta intensità, come ogni colorante fluorescente, è irreversibile fotodanneggiata (fotodecolorate)<sup> 3-5</sup>. È importante sottolineare che, poiché pH basso placa l'assorbimento di fotoni, in superficie espressa settembre può essere fotodecolorate settembre intracellulare, mentre non è influenzato dalla illuminazione ad alta intensità<sup> 6-10</sup>.</p><p class="jove_content"> FRAP (recupero di fluorescenza dopo photobleaching) di set-tagged proteine è una tecnica utile e potente per la valutazione delle dinamiche di proteine a livello della membrana plasmatica. Quando le proteine fluorescenti sono contrassegnati fotodecolorate in una regione di interesse (ROI) il recupero della fluorescenza si verifica a causa del movimento delle proteine gregge SEP-tag nella regione sbiancato. Questo può avvenire per diffusione laterale e / o da esocitosi di non-fotodecolorate recettori fornita tramite<em> De novo</em> Sintesi o riciclo (vedi fig. 1). La frazione di proteina immobile e mobile può essere determinato e la mobilità e la cinetica della frazione diffusibile può essere interrogato in condizioni basali e stimolati, come l'applicazione agonista o stimoli attivazione neuronale come NMDA o KCl domanda<sup> 8,10</sup>.</p><p class="jove_content"> Si descrivono tecniche fotodecolorazione progettate per visualizzare selettivamente il recupero di fluorescenza attribuibile esocitosi. In breve, un ROI è fotodecolorate una volta, come con i protocolli standard FRAP, seguita, dopo una breve ripresa, con ripetitiva sbiancamento delle regioni fiancheggianti. Questo protocollo 'FRAP-FLIP', sviluppato nel nostro laboratorio, è stato utilizzato per caratterizzare il traffico dei recettori AMPA a spine dendritiche<sup> 10</sup>, Ed è applicabile ad una vasta gamma di studi di traffico per valutare il traffico intracellulare e esocitosi.</p>
Protocol
1. Coltura cellulare, la trasduzione virale, e l'espressione proteica Cultura neuroni dell'ippocampo ad alta densità da embrionali cuccioli di ratto al giorno 18 (E18) su poli-L-lisina rivestite con vetrini per 14-25 giorni in vitro (DIV). 6-24 ore prima degli esperimenti dal vivo, le cellule con virus attenuato trasducono Sindbis contenenti la proteina di membrana di interesse, contrassegnati con il super-dell'eclittica pHluorin (SEP). Aggiungere il pseudovirione mezzo contenente direttamente al vetrino contenente 1 ml di mezzo condizionato e restituito al incubatore cultura. Il titolo e il tempo per l'espressione proteica dopo trasduzione virale varierà a seconda del lotto virus e deve essere determinata per ciascuna partita prima di iniziare esperimenti cellule vive. 2. FRAP-FLIP Live Cell Imaging Attrezzature set-up Trasferire il vetrino alla camera di imaging di un Axiovert META Zeiss LSM 510 microscopio confocale.Per minimizzare le fluttuazioni di potenza durante l'imaging, garantire il microscopio è stato attivato, con uscita laser 100%, per almeno 20 minuti prima di imaging. Immediatamente, sostituire il mezzo di coltura con pre-riscaldato (37 ° C) Soluzione di registrazione extracellulare contenente 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 15 mM glucosio, 1.5 mM CaCl 2, 1,5 mM MgCl 2, 20-25 mM HEPES (pH regolato 7,4 con NaOH) e posizionare la camera di pre-riscaldato fase (37 ° C) del Zeiss Axiovert. Assicurarsi che l'osmolarità della soluzione registrazione extracellulare viene regolata entro 10 mOsm del terreno di coltura. Purché non evaporazione significativa si verifica durante il periodo di tempo l'esperimento, questa CO 2 soluzione indipendente è adatta per esperimenti di breve (<10 ore). completando con 1-2 mm di bicarbonato sodio è consigliabile. definire i parametri imaging cattura in primo luogo, identificare un neurone esprime il pro ricombinanteproteina interesse e metterla a fuoco. olio 63x opposta, acquisire un'immagine della cellula intera utilizzando 488nm eccitazione luce laser bassa potenza laser. per ridurre al minimo photobleaching, utilizzare una velocità elevata nominale (7-9) la risoluzione pixel (512-512) mantenendo scansione totale <1 secondo. selezionare parte dendrite immagine zoom catturare frame contenente roi (~ x 1,5-2,5 ottico). ove possibile, garantire campo visivo contiene diversi processi modo che le misurazioni dendriti riferimento può essere ottenuta, determinare se non specifico fotodegradazione dovuta all'acquisizione sta avvenendo. regolare filtri, foro stenopeico, guadagno del rivelatore fluorescenza consentire massima dall'eccitazione minimal ma saturazione limitata. diametro grandi dimensioni si consiglia, massimizzare raccolta fotoni (2μm adatta spine dei ternari). rilevatore dovrebbe abbastanza forte rilevare piccoli incrementi fluorescenza,tale prime immagini, prima fotodecolorazione superare 10% saturi. salvare questa configurazione da pre > Figura 1. Schematica dei principi di FRAP vs FRAP-FLIP protocolli Questo schema illustra i risultati di un protocollo di FRAP regolare rispetto a 'FRAP-FLIP', usando sep-tagged recettori. Recupero fluorescenza in FRAP tradizionale viene visualizzata sulla sinistra. Misurato il recupero di fluorescenza nella centralissima ROI è attribuito ad una combinazione di laterali di diffusione f recettori SEP-tag non-fotodecolorate al di fuori del ROI fotodecolorate e l'inserimento di recettori attraverso il riciclaggio e / o de novo esocitosi nel pozzo dendritica. Al contrario, la fotodecolorate ripetitiva del ROI accompagnamento illustrato nella destra, mostra come questa modifica 'FRAP-FLIP' protocollo di silenzi recupero a causa di diffusione laterale. Come tale, qualsiasi recupero fluorescenza misurata può essere attribuito al inserimento diretto nella ROI. Figura 2.Inserimento di SEP-GluA2 nella membrana plasmatica sull'albero dendritico A) Un neurone dell'ippocampo esprime SEP-GluA2, selettivamente fotodecolorate lungo una regione di dendrite. Lo schema illustra la regione di dendrite che è stato ripreso, mentre il pannello superiore sinistra evidenzia la ROI che sono state selezionate per photobleaching. La grande area bianca in scatola è stata sbiancata volta, seguita da ripetitivo sbiancamento delle regioni fiancheggianti in scatola, evidenziati con una freccia doppia blu. Questo pannello mostra la dendrite prima photobleaching. La freccia rossa indica la ROI misurato, mostrata in alto ingrandimento nei pannelli inferiori. B) mostra l'intensità di fluorescenza della ROI misurata nel corso del tempo dell'esperimento, tracciati come livello di grigio della ROI (non normalizzato). La freccia nera evidenziare la timepoint del fotosbiancante iniziale e freccia verde indica l'inizio del photobleaching ripetitivo. Af indica °e aumento della fluorescenza osservata nel corso del periodo di recupero, grazie all'inserimento di settembre-GluA2 nel pozzo dendritica. Successivamente pH basso e pH 7,4 + NH 4 Cl lavaggi confermare che la fluorescenza recuperato riguarda superficie recettori espressi. Figura 3. Riciclaggio Riciclaggio e laterali vs diffusione del SEP-GluK2 sull'albero dendritico in seguito al trattamento cyclohexamide A) Un neurone dell'ippocampo esprime SEP-GluK2, selettivamente fotodecolorate con FRAP parallelo e 'FRAP-FLIP' protocolli di recupero eseguiti lungo separata ROI dendritica. Il neurone è stato oggetto di pretrattamento con cyclohexamide, per bloccare la sintesi proteica (2 ore a 200 pg / ml). Lo schema illustra la regione di dendrite che è stato ripreso, mentre il pannello di sinistra evidenziando la ROI che sono state selezionate per photobleaching. The ampio spazio bianco in scatola è stata sbiancata volta, seguita da ripetitivo sbiancamento delle regioni fiancheggianti in scatola, del dendrite inferiore solo, evidenziata con una freccia doppia blu. Questo pannello mostra i dendriti prima photobleaching. Le frecce rosse evidenziare il ROI mostrato in alto ingrandimento in B) che illustra il recupero di fluorescenza in FRAP tradizionale contro il protocollo del 'FRAP-FLIP'. Il confronto dei livelli di intensità di fluorescenza nella fase tardiva di recupero (pannelli terzi) mostrano il contributo di diffusione laterale e riciclaggio rispetto riciclaggio sola. C) mostra l'intensità di fluorescenza della ROI misurata nel corso del tempo dell'esperimento, tracciate come intensità normalizzate valori. La freccia nera evidenziare la timepoint del fotosbiancante iniziale e freccia verde indica l'inizio del photobleaching ripetitivo. Af rec indica il recupero transitorio dovuto al riciclaggio recettore, determinato dal FRAP / FLIP dendrite mentre Afdiff misura il contributo di diffusione laterale della SEP-GluK2 nel pozzo dendritica nella 'FRAP solo' ROI. L'aumento transitorio è seguita da graduale diminuzione del segnale, corrispondente alla corsa verso il basso di recettori disponibili a seguito di trattamento cyclohexamide. Il pH basso e successiva pH 7,4 + NH 4 Cl lavaggi confermare che la fluorescenza recuperato riguarda superficie recettori espressi.
Discussion
Abbiamo descritto una strategia innovativa per visualizzare le componenti di traffico proteina di membrana plasmatica. L'approccio combinatorio di photobleaching tecniche con proteine SEP-tag permette selettivamente l'inserimento della membrana plasmatica eventi da valutare. Continuamente photobleaching le proteine di membrana nelle regioni fiancheggianti durante il recupero, il metodo 'FRAP-FLIP' valuta il contributo del traffico vescicolare al recupero fluorescenza. Questo nuovo approccio permette la registrazione diretta di inserimento proteina di membrana, permettendo sia il numero di sotto-compartimenti dove si osserva il recupero e l'ampiezza del recupero (Af) allo stato stazionario da determinare. Inoltre, il confronto di FRAP con e senza FLIP permette la percentuale di recupero imputabile diffusione laterale da calcolare.
Inoltre, nello stesso esperimento, le regioni di non-fotodecolorate dendrite adiacente alle regioni fiancheggianti fotodecolorate può esserequalitativamente valutati durante il recupero, la perdita di fluorescenza osservata in queste regioni sarà a causa della diffusione laterale dei recettori fotodecolorate in questi non-fotodecolorate segmenti del dendrite.
Questo protocollo selettivo photobleaching può essere utilizzato per indagare su una serie di processi cellulari come il traffico che caratterizza excocytosis nella membrana plasmatica nelle sottozone definite (ad esempio, dendriti e spine) FRAP o valutare il contributo di inserimento laterale vs diffusione conducendo FRAP parallelo e ' -FLIP 'protocolli lungo dendriti adiacenti (Fig. 3).
Chiaramente, mentre le linee guida specifiche sono state presentate, ogni laboratorio sarà necessario ottimizzare i parametri di imaging in base agli esemplari ed attrezzature specifiche. È importante sottolineare che tutti i recettori di superficie della ROI devono essere fotodecolorate, indipendente dal asse z piano focale, ma senza danni significativi fototossico o non-specifici photobleaching. NoiERS deve esercitare cautela quando si tenta questo protocollo al soma cella, come l'alta percentuale di compartimenti pH relativamente bassi intracellulari genere si traduce in fluorescenza di fondo ad alto contenuto di queste regioni. Inoltre, mentre abbiamo dimostrato come questa tecnica può essere applicata in svariati modi, prima di iniziare selettivi photobleaching esperimenti su un nuovo SEP-tagged costruire, vi consigliamo una prima caratterizzazione dei recettori tag viene prima effettuata, come descritto da Ashby et al 2.
In generale, questo metodo è un adattamento potente e versatile del protocollo FRAP standard, consentendo eventi di inserzione in membrana plasmatica da valutare in tempo reale.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati al Wellcome Trust e del CER per il sostegno finanziario. IMGG è un EMBO Fellow. KLH è un BBSRC finanziato dottorando. Ringraziamo Filippo Rubin e Patrick Tidball per il supporto cultura tecnica e la cella e il dottor Andrew Doherty per la manutenzione e l'assistenza con i microscopi.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 24mm glass coverslips | VWR International | 631-0161 | |
| Poly-l-lysine | Sigma | P2636 | 1mg/ml in borate buffer to coat coverslips |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 2% in neuronal plating and feeding medium |
| Penicillin Streptomycin | Sigma | P0781 | 1% in neuronal plating and feeding medium |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 2mM / 0.8mM in plating/feeding medium |
| Horse Serum | Biosera | DH-291H | 10% in neuronal plating media only |
| pSIN ReP5 cloning vector | Invitrogen | K75001 | For Sindbis virus production |
| LSM510 META confocal system | Zeiss | ||
| Image J Software | NIH | open access software. All plugins described herein are available at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/ |
Referências
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- Swaminathan, R., Hoang, C. P., Verkman, A. S. Photobleaching recovery and anisotropy decay of green fluorescent protein GFP-S65T in solution and cells: cytoplasmic viscosity probed by green fluorescent protein translational and rotational diffusion. Biophys. J. 72, 1900-1907 (1997).
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Lateral DiffusionExocytosisMembrane ProteinsCultured NeuronsFluorescence RecoveryFluorescence-loss PhotobleachingTraffickingReceptorsIon ChannelsSynaptic ProteinsSuper-ecliptic PHluorinLive Cell ImagingPlasma Membrane ProteinsProtonationPhoton AbsorptionFluorescence EmissionIntracellular Trafficking EventsLow PH CompartmentsNeutral PH Extracellular EnvironmentPhotodamagePhotobleachingFRAP (fluorescence Recovery After Photobleaching)Protein Dynamics
Citar este artigo
Hildick, K. L., González-González, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching. J. Vis. Exp. (60), e3747, doi:10.3791/3747 (2012).