마우스 뇌의 장기 이미징을위한 세련된와 철근 Thinned-해골 창
Summary
우리는 mm에 걸쳐하고 뇌의 염증없이 몇 달 동안 안정 마우스 두개골에 이미지 창을 형성하는 방법을 제시한다. 이 방법은 잘 두 광자 현미경을 사용하여 혈류, 세포 역학 및 세포 / 혈관 구조의 종방향 연구에 가장 적합합니다.
Abstract
생체내에서는 대뇌 피질 기능의 영상은 intracranial 환경의 방해없이 뇌로 광 액세스가 필요합니다. 우리는 직경 몇 mm에 걸쳐 그리고 수 개월 동안 안정 마우스 두개골에 광택과 철근 thinned 두개골 (포트) 윈도우를 구성하는 방법을 제시한다. 두개골이 광학 선명도를 달성하는 훈련을 실시 손으로 두께 10-15 μm의에 thinned하고 있으며, 다음으로 cyanoacrylate 접착제와 덮개 유리로 중첩됩니다 : 1) 강성, 2를 제공하는 것은) 뼈 regrowth을 억제하고 3) 빛의 산란을 감소 뼈 표면에 부정에서. 두개골이 터진 않았으므로, 공부중인 프로세스에 영향을 미칠 수있는 염증이 크게 줄어 듭니다. 최대 대뇌 피질의 표면 아래 250 μm의로의 이미징 깊이는 두 광자 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 얻을 수 있습니다. 이 창문은 잘 anesthetized 정신 모두 준비에서 대뇌 혈류와 세포 기능을 공부하기 적합합니다. 그것은 더 이상 작전을 제공합니다portunity는 optogenetics를 사용하여 세포의 활동을 조작하거나 photosensitizers 순환의 조사의 대상이 혈관의 혈액 흐름을 방해한다.
Protocol
1. 수술 준비하기 전 초음파 세척기의 Maxizyme, 외과 우유의 혼합물에 sonicating하여 수술 도구를 청소합니다. 각 실험 전에 수술 도구를 압력솥. 필요한 모든 시약과 disposables를 사용할 수 있는지 확인합니다. 시약 및 disposables의 목록은 표 2에 제공됩니다. 가능하면 노출된 조직과 접촉 시약 및 disposables는 살균해야합니다. 마취를 유도. 생존 연구에 적합한 일반 anesthetic…
Discussion
두 광자 포트 창을 통해 영상은 레이저 빛을 attenuates하고 더 깊이 8 시에 광학 aberrations을 추가 thinned 뼈 및 경질 통해 전송을 필요로합니다. 그러나이 단점에도 불구하고 최대 pial 표면 아래 250 μm의에 이미징 깊이는 900 nm의 여기를 구현할 수 있습니다. 그레이터 이미징 깊이는 원칙적으로 13 이상 여기 파장과 수도 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 완전한 craniotomy 14, 15과</su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 미국 심장 협회 (AYS로 포스트 박사 교제)와 국립 보건원 (MH085499, EB003832 및 OD006831 디케이까지)에 의해 지원되었다. 우리는 원고에 대한 의견에 대해 베스 프리드먼과 파블로 무계획 감사드립니다.
Materials
| Agent | Route of delivery | Dose for mouse | Duration | Notes | Source | Ref Ref |
| Pentobarbital (Nembutal) | IP | 90 μg/g | 15-60 min | Narrow safety margin. Work up to proper dose of anesthesia slowly. Supplement 10 % of induction dose as required. | 036093; Butler Schein | 7 |
| Ketamine (Ketaset) mixed with Xylazine (Anased) | IP | 60 μg/g (K)
10 μg/g (X) (mix in same syringe) |
20-30 min | Xylazine is co-injected as a muscle relaxant and analgesic. Supplement only Ketamine at 50% of induction dose as required. | (K) 010177, (X) 033198; Butler Schein | 7 |
| Isoflurane (Isothesia) | Inhalation | 4% mean alveolar concentration (MAC) for induction; 1-2% MAC for maintenance | 4-6 h. | Provided in mixture of 70% oxygen and 30% nitrous oxide. Prolonged anesthesia leads to slow recovery. | 029403; Butler Schein | 26 |
Table 1. Suggested anesthetic agents for survival studies.
| ITEM | COMPANY | CATALOG # / MODEL |
| Betadine | Butler Schein | 6906950 |
| Buprenorphine (Buprenex) | Butler Schein | 031919 |
| Fluorescein isothiocyanate dextran, 2 MDa molecular weight | Sigma | FD2000S |
| Isopropyl alcohol | Fisher | AC42383-0010 |
| Lactated Ringer’s Solution | Butler Schein | 009846; |
| Lidocaine solution, 2 % (v/v) | Butler Schein | 002468 |
| Saline | Butler Schein | 009861 |
| Surgical Milk | Butler Schein | 014325 |
| Texas Red dextran, 70 kDa molecular weight | Invitrogen | D1864 |
| Maxizyme | Butler Schein | 035646 |
| DISPOSABLES | ||
| Carbide burrs, 1/2 mm tip size | Fine Science Tools | 19007-05 |
| Cottoned tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-100 |
| Cover Glass, no. 0 thickness | Thomas Scientific | 6661B40 |
| Cyanoacrylate glue | ND Industries | 31428 H04308 |
| Gas duster | Newegg | N82E16848043429 |
| Grip cement powder | Dentsply | 675571 |
| Grip cement solvent | Dentsply | 675572 |
| Insulin syringe, 0.3 mL volume with 29.5 gauge needle | Butler Schein | 018384 |
| Nut and bolt to secure the head | Digikey | Nut, H723-ND; bolt, R2-56X1/4-ND |
| Opthalmic ointment | Butler Schein | 039886 |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | 12-460-448 |
| Screws, self-tapping #000 | J.I. Morris Company | FF000CE125 |
| Silicone aquarium sealant | Perfecto Manufacturing | 31001 |
| Tin oxide powder | Mama’s Minerals | EQT-TINOX |
| EQUIPMENT | ||
| Glass scribe | Fisher Scientific | 08-675 |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | OPMI-1 FC |
| Electric powered drill | Foredom or Osada | K.1020 (Foredom) or EXL-M40 (Osada) |
| Electrical razor | Wahl | Series 8900 |
| Forceps, Dumont no. 55 | Fine Science Tools | 11255-20 |
| Feedback regulated heat pad | FHC | 40-90-8 (rectal thermistor, 40-90-5D-02; heat pad, 40-90-2-07) |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda | IsoTec4 |
| Pulse oximeter | Starr Life Sciences | MouseOx |
| Screwdriver, miniature | Garret Wade | 26B09.01 |
| Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 (with mouse anesthesia mask and non-rupture ear bars) |
| Surgical scissors, blunt end | Fine Science Tools | 14078-10 |
| Ultrasonic cleaner | Fisher Scientific | 15-335-30 |
Table 2. List of specific reagents, disposables and equipment.
Referências
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Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (61), e3742, doi:10.3791/3742 (2012).