Generering av Utførte regulatoriske T-celler fra primære humane naiv og Minne T-celler

Utvikling og vedlikehold av immunsuppressive CD4 ⁺ regulatoriske T-celler (Tregs) bidra til perifer toleranse for å forbli i immunologisk homeostase med den enorme mengden av selvtillit og Commensal antigener i og på menneskekroppen. Forstyrrelsene i balansen mellom Tregs og inflammatoriske konvensjonelle T-celler kan resultere i immunopathology eller kreft. Selv om terapeutisk injeksjon av Tregs har vist seg å være effektiv i murine modeller av ^pt kolitt, type I ² diabetes, revmatoid artritt og graft versus host sykdom, ⁴ flere grunnleggende forskjeller i menneskelige versus mus Treg biologi ⁵ har hittil utelukket klinisk bruk. Mangelen på tilstrekkelig antall, renhet, stabilitet og homing spesifisitet av terapeutisk Tregs nødvendiggjorde en dynamisk plattform for menneskelig Treg utvikling som å optimalisere forholdene for sin ex vivo ekspansjon ^6.

Her har vi describe en metode for differensiering av indusert Tregs (iTregs) fra et enkelt menneske perifert blod donor som kan brytes ned i fire stadier: isolasjon av perifere mononukleære blodceller, magnetisk utvalg av CD4 ⁺ T celler, in vitro cellekultur og fluorescens aktivert celle sortering (FACS) av T-celle undergrupper. Siden Treg signaturen transkripsjonsfaktor forkhead boksen P3 (FoxP3) er en aktivering-indusert transkripsjonsfaktor i mennesker ⁷ og ingen andre unike markør eksisterer en kombinatorisk panel av markører må brukes til å identifisere T-celler med suppressor aktivitet. Etter seks dager i kultur, kan celler i systemet vårt skal avgrenses til naive T-celler, minne T-celler eller iTregs basert på deres relative uttrykk for CD25 og CD45RA. Som minne og naive T-celler har forskjellige rapporterte polarisering krav og plasticities ^8, pre-sortering av den første T-celle befolkningen inn CD45RA ⁺ og CD45RO ⁺ undergrupper kan be brukes til å undersøke disse avvikene. Konsistent med andre, vår CD25 ^Hi CD45RA ^– iTregs uttrykte høye nivåer av FoxP3 ^9, GITR og CTLA-4 ¹¹ og lave nivåer av CD127 ^12. Etter FACS av hver populasjon, kan resulterende celler brukes i en Lyddemper analysen som evaluerer den relative evnen til å forsinke spredning av carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-merket autolog T-celler.