בידוד והתרבות של האדם בחוש הטעם תאים Fungiform גבשושיות
Summary
המטרה היא לפתח פרוטוקול לשחזור לבידוד ושמירה לטווח ארוך של תרבויות אנושיות הטעם תאים fungiform גבשושיות. תאים מאדם fungiform גבשושיות מתקבל על ידי ביופסיה נשמרו בהצלחה במשך יותר משמונה קטעים (12 חודשים) בתרבות ללא אובדן הכדאיות.
Abstract
תאים הטעם הם מאוד מיוחדים, עם מאפיינים ייחודיים, היסטולוגית מולקולריות ופיזיולוגיות המאפשרים זיהוי של מגוון רחב של גירויים פשוטים ומולקולות כימיות מורכבות הכלולים מזונות. ב האדם גבשושיות, fungiform הפרט להכיל מאפס עד כמה שרק 20 בלוטות הטעם. אין פרוטוקול מבוסס תאים אנושיים culturing הטעם, אם כי היכולת לשמור על גבשושיות הטעם התאים בתרבית תאים במשך מחזורים רבים תהיה התועלת רבה לאפיון תכונות מולקולריות, רגנרטיבית, ופונקציונלי של תאים אלה ייחודיים חושיות. מחקרים קודמים של תאים הטעם היה לעשות שימוש טרי תאים מבודדים בתרבות העיקרי, תרבויות explant של מכרסמים, או חצי שלמות בלוטות הטעם של פרוסות רקמה 1,2,3,4. למרות כל ההכנות הללו יש יתרונות, פיתוח לטווח ארוך תרבויות היתה יכולה לספק יתרונות משמעותיים, במיוחד מחקרים של התא טעם שגשוג differentiation. מספר קבוצות, כולל שלנו, היה מעוניין בפיתוח והקמת תא מודלים טעם ותרבות. רוב הניסיונות תאים הטעם תרבות דיווחו על יכולת הקיום מוגבל, עם תאים בדרך כלל לא מעבר שנמשך 3-5 ד 5,6,7,8. אנחנו לאחרונה דווח על שיטה מוצלחת לתרבות המורחבת של טעם תאים מכרסמים 9. אנחנו כאן לדווח לראשונה על הקמת במערכת התרבות חוץ גופית עבור מבודדים תאים אנושיים הטעם fungiform גבשושיות. תאים מאדם fungiform גבשושיות מתקבל על ידי ביופסיה נשמרו בהצלחה במשך יותר משמונה קטעים (12 חודשים) בתרבות ללא אובדן הכדאיות. תאים מוצגים תכונות מולקולריות ופיזיולוגיים רבים האופייניים לתאי הטעם בוגרים. Gustducin ו phospholipase C β2, (PLC-β2) mRNA התגלו תאים רבים מהתגובה transcriptase-פולימראז הפוך שרשרת ואושרו על ידי סידור. ניתוח Immunocytochemistry הפגינו נוכחות של משבducin ו PLC-β2 ביטוי בתאים בתרבית הטעם. בתרבית תאים fungiform אדם גם הציגו עליות סידן תוך תאי בתגובה ריכוזים מתאימים של גירויים הטעם מספר המצביעים על כך קולטני הטעם, לפחות בחלק מן המסלולים איתות נכחו. תוצאות אלו מצביעות על כך מספיק תאים הטעם של בני אדם בוגרים יכול להיות שנוצר ומתוחזק על לפחות שמונה קטעים. רבים מן התאים לשמור על מאפיינים פיזיולוגיים ביוכימיים של תאים מבודדים בחריפות מן האפיתל טעם מבוגר כדי לתמוך השימוש בהם כמערכת מודל טעם. מערכת זו תאפשר מחקרים נוספים של התהליכים המעורבים בידול התפשטות, והתפקוד של תאים קולטני הטעם של יונקים לקראת במבחנה.
האדם גבשושיות fungiform טעם בשימוש להקמת התרבות האנושית תא fungiform נתרמו לחקר בעקבות הסכמה מדעת נכונה תחת פרוטוקולים מחקר נבדקוואושרה על ידי ועדת IRB. פרוטוקול (# 0934) אושרה על ידי שולמן Associates מוסדי סקירה עמוד Inc, סינסינטי, אוהיו. בפרוטוקול נכתב מתחת מבוסס על פרמטרים שפורסמו שדווחו על ידי Ozdener et al. 2011 10.
Protocol
Discussion
אנו שומרים על התאים המתקבלים גבשושיות fungiform האדם טעם כבר למעלה מ 8 קטעים, פורש תקופה של 12 חודשים. תרבויות אלה לייצר תאים חדשים, שרבים מהם לפירעון במבחנה לשלב שבו הם מביעים סמנים שונים של בוגרים ניצן סוגים הטעם סלולריים, בנוסף תכונות מולקולריות ופיזיולוגיות המפתח ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים איימי מאיירס Quayson ESI עבור כישורים טכניים ועזרה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי NSF 0216310 ו Givaudan Inc מענק (נר).
Materials
| Name of the reagent | Company |
| MCDB 123 | Sigma-Aldrich |
| Iscove’s DMEM Medium | MediaTech |
| Elastase | Sigma-Aldrich |
| Pronase E | Sigma-Aldrich |
| Elastase | Worthington |
| Soy bean trypsin inhibitor | Worthington |
| Collagenase type 1 | Worthington |
| Rat tail collagen type 1 | BD Sciences |
| Fura-2 AM | Molecular Probes |
| Superscript First Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen |
| Leica TCS SP2 Spectral Confocal Microscope | Leica Microsystems Inc. |
| Discovery-1 imaging station and Metamorph software | Molecular Devices |
| Small fine-tip forceps and extra fine spring scissors | Fine Science Tools |
Referências
- Mbiene, J. P., Maccallum, D. K., Mistretta, C. M. Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia. J. Comp. Neurol. 377, 324-340 (1997).
- Miyamoto, T., Fujiyama, R., Okada, Y., Sato, T. Strain difference in amiloride-sensitivity of salt-induced responses in mouse non-dissociated taste cells. Neurosci. Lett. 277, 13-16 (1999).
- Caicedo, A., Jafri, M. S., Roper, S. D. In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells. J. Neurosci. 20, 7978-7985 (2000).
- Qin, Y. M., Shi, J. Q., Zhang, G. H., Deng, S. P., Wang, T. H. A reliable method to obtain cells of taste buds from fungiform papillae of mice. Acta Histochem. 112, 107-112 (2010).
- Spielman, A. I., Mody, I., Brand, J. G., Whitney, G., MacDonald, J. F., Salter, M. W. A method for isolating and patch-clamping single mammalian taste receptor cells. Brain Res. 503, 326-329 (1989).
- Kishi, M., Emori, Y., Tsukamoto, Y., Abe, K. Primary culture of rat taste bud cells that retain molecular markers for taste buds and permit functional expression of foreign genes. Neurociência. 106, 217-225 (2001).
- Ruiz, C. J., Stone, L. M., McPheeters, M., Ogura, T., Bottger, B., Lasher, R. S., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. Maintenance of rat taste buds in primary culture. Chem. Senses. 26, 861-873 (2001).
- Stone, L. M., Tan, S. S., Tam, P. P., Finger, T. E. Analysis of cell lineage relationships in taste buds. J. Neurosci. 22, 4522-4529 (2002).
- Ozdener, H., Yee, K. K., Cao, J., Brand, J. G., Teeter, J. H., Rawson, N. E. Characterization and long-term maintenance of rat taste cells in culture. Chem. Senses. 31, 279-290 (2006).
- Ozdener, M. H., Brand, J. G., Spielman, A. I., Lischka, F. W., Teeter, J. H., Breslin, P. A., Rawson, N. E. Characterization of Human Fungiform Papillae Cells in Culture. Chem. Senses. 36, 601-612 (2011).
- Gomez, G., Rawson, N. E., Hahn, C. G., Michaels, R., Restrepo, D. Characteristics of odorant elicited calcium changes in cultured human olfactory neurons. J. Neurosci. Res. 62, 737-749 (2000).
- Wolozin, B., Sunderland, T., Zheng, B. B., Resau, J., Dufy, B., Barker, J., Swerdlow, R., Coon, H. Continuous culture of neuronal cells from adult human olfactory epithelium. J. Mol. Neurosci. 3, 137-146 (1992).
- Wick, N., Saharinen, P., Saharinen, J., Gurnhofer, E., Steiner, C. W., Raab, I., Stokic, D., Giovanoli, P., Buchsbaum, S., Burchard, A., Thurner, S., Alitalo, K., Kerjaschki, D. Transcriptomal comparison of human dermal lymphatic endothelial cells ex vivo and in vitro. Physiol. Genomics. 17, 179-192 (2007).
- Fu, L., Zhu, L., Huang, Y., Lee, T. D., Forman, S. J., Shih, C. C. Derivation of neural stem cells from mesenchymal stemcells: evidence for a bipotential stem cell population. Stem Cells Dev. 17, 1109-1121 (2008).
- Sandow, S. L., Grayson, T. H. Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 297, H1-H7 (2009).
