Isolierung und Kultivierung humaner Zellen pilzförmige Papillen Geschmack
Summary
Wir wollten eine reproduzierbare Protokoll für die Isolierung und die Pflege langfristiger Kulturen von humanen pilzförmigen Papillen Geschmack Zellen zu entwickeln. Zellen aus menschlichen fungiformen Papillen durch Biopsie gewonnen wurden erfolgreich in der Kultur mehr als acht Durchgängen (12 Monate) aufrecht erhalten, ohne Verlust der Lebensfähigkeit.
Abstract
Geschmack Zellen sind hoch spezialisierte, mit einzigartigen histologischen, molekularen und physiologischen Eigenschaften, die den Nachweis einer Vielzahl von einfachen und komplexen Reize chemische Moleküle in Nahrungsmitteln enthalten ermöglichen. In der menschlichen, individuellen fungiformen Papillen enthalten von null bis zu 20 Geschmacksknospen. Es gibt keine festgelegten Protokoll zur Kultivierung von Zellen menschlichen Geschmack, obwohl die Fähigkeit, Geschmack Papillen Zellen in Kultur für mehrere Zyklen Zelle aufrechtzuerhalten wäre von großem Nutzen für die Charakterisierung der molekularen, regenerative und funktionellen Eigenschaften dieser einzigartigen Sinneszellen sein. Frühere Studien des Geschmacks-Zellen wurden unter Verwendung frisch isolierten Zellen in Primärkultur, Explantatkulturen von Nagern, oder semi-intakten Geschmacksnerven in Gewebeschnitten 1,2,3,4. Obwohl jedes dieser Präparate hat Vorteile, wäre die Entwicklung von langfristigen Kulturen erhebliche Vorteile zur Verfügung gestellt haben, insbesondere für Studien des Geschmacks Zellproliferation und verschierenzierung. Mehrere Gruppen, einschließlich der unsrigen, waren interessiert an der Entwicklung und Etablierung von Zellkultur-Modellen Geschmack. Die meisten Versuche, Kultur Geschmack Zellen haben begrenzte Lebensfähigkeit berichtet, die mit Zellen in der Regel nicht dauerhaft über 3-5 d 5,6,7,8. Vor kurzem berichteten wir auf ein erfolgreiches Verfahren für die verlängerte Kultur von Nagetier Geschmack Zellen 9. Wir berichten hier zum ersten Mal die Etablierung eines in vitro-Kultur-System für isolierte menschliche Zellen pilzförmige Papillen Geschmack. Zellen aus menschlichen fungiformen Papillen durch Biopsie gewonnen wurden erfolgreich in der Kultur mehr als acht Durchgängen (12 Monate) aufrecht erhalten, ohne Verlust der Lebensfähigkeit. Zellen zeigten viele molekulare und physiologische Merkmale charakteristisch für reife Geschmack Zellen. Gustducin und Phospholipase C β2, (PLC-β2) mRNA wurden in vielen Zellen durch reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion festgestellt und bestätigt durch Sequenzierung. Immunzytochemie Analyse zeigte die Anwesenheit von Böducin und PLC-β2-Expression in kultivierten Zellen Geschmack. Kultivierte humane fungiformes Zellen zeigten auch Erhöhung des intrazellulären Calcium in Reaktion auf die entsprechenden Konzentrationen von mehreren Geschmacksreize anzeigt, dass Geschmacksrezeptoren und wenigstens einige der Signalwege vorhanden waren. Diese Ergebnisse zeigen, dass genügend Geschmack Zellen von erwachsenen Menschen erzeugt und aufrechterhalten werden für mindestens acht Passagen. Viele der Zellen behalten physiologischen und biochemischen Merkmale von akut isolierten Zellen aus dem erwachsenen Geschmack Epithel auf ihre Verwendung als Modell Geschmack zu unterstützen. Dieses System ermöglicht weitere Untersuchungen der Prozesse in der Proliferation, Differenzierung und Funktion von Säuger-Zellen-Rezeptor-Geschmack de einem In-vitro-Herstellung beteiligt.
Menschliche pilzförmige Papillen Geschmack für den Aufbau menschlicher fungiformen Zellkultur verwendet wurden, für die Forschung nach einer ordnungsgemäßen Einwilligung unter Forschung Protokolle, die gespendet wurden bewertetund durch den IRB Ausschuss genehmigt. Das Protokoll (# 0934) wurde von Schulman Associates Institutional Review Board Inc., Cincinnati, OH genehmigt. Geschrieben Protokoll unten auf der veröffentlichten Parameter durch Ozdener et al basiert. 2011 10.
Protocol
Discussion
Wir haben Zellen aus menschlichen pilzförmige Papillen Geschmack für über 8 Passagen erhalten gepflegt, über einen Zeitraum von 12 Monaten. Diese Kulturen generieren neue Zellen, von denen viele in-vitro-Reifung auf die Bühne, wo sie mehrere Marker von reifen Geschmacksknospe Zelltypen, zum Ausdruck bringen zusätzlich zu den wichtigsten molekularen und physiologischen Eigenschaften der Geschmack Rezeptorzellen. Die Anwesenheit von Gustducin-und PLC-β2 Immunreaktivität in Teilmengen von kultivierten Zell…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns bei Aimee Myers und ESI Quayson für technische Kompetenz und Hilfe. Diese Arbeit wurde zum Teil durch NSF 0216310 und Givaudan Inc Zuschuss (NER) unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company |
| MCDB 123 | Sigma-Aldrich |
| Iscove’s DMEM Medium | MediaTech |
| Elastase | Sigma-Aldrich |
| Pronase E | Sigma-Aldrich |
| Elastase | Worthington |
| Soy bean trypsin inhibitor | Worthington |
| Collagenase type 1 | Worthington |
| Rat tail collagen type 1 | BD Sciences |
| Fura-2 AM | Molecular Probes |
| Superscript First Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen |
| Leica TCS SP2 Spectral Confocal Microscope | Leica Microsystems Inc. |
| Discovery-1 imaging station and Metamorph software | Molecular Devices |
| Small fine-tip forceps and extra fine spring scissors | Fine Science Tools |
Referências
- Mbiene, J. P., Maccallum, D. K., Mistretta, C. M. Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia. J. Comp. Neurol. 377, 324-340 (1997).
- Miyamoto, T., Fujiyama, R., Okada, Y., Sato, T. Strain difference in amiloride-sensitivity of salt-induced responses in mouse non-dissociated taste cells. Neurosci. Lett. 277, 13-16 (1999).
- Caicedo, A., Jafri, M. S., Roper, S. D. In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells. J. Neurosci. 20, 7978-7985 (2000).
- Qin, Y. M., Shi, J. Q., Zhang, G. H., Deng, S. P., Wang, T. H. A reliable method to obtain cells of taste buds from fungiform papillae of mice. Acta Histochem. 112, 107-112 (2010).
- Spielman, A. I., Mody, I., Brand, J. G., Whitney, G., MacDonald, J. F., Salter, M. W. A method for isolating and patch-clamping single mammalian taste receptor cells. Brain Res. 503, 326-329 (1989).
- Kishi, M., Emori, Y., Tsukamoto, Y., Abe, K. Primary culture of rat taste bud cells that retain molecular markers for taste buds and permit functional expression of foreign genes. Neurociência. 106, 217-225 (2001).
- Ruiz, C. J., Stone, L. M., McPheeters, M., Ogura, T., Bottger, B., Lasher, R. S., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. Maintenance of rat taste buds in primary culture. Chem. Senses. 26, 861-873 (2001).
- Stone, L. M., Tan, S. S., Tam, P. P., Finger, T. E. Analysis of cell lineage relationships in taste buds. J. Neurosci. 22, 4522-4529 (2002).
- Ozdener, H., Yee, K. K., Cao, J., Brand, J. G., Teeter, J. H., Rawson, N. E. Characterization and long-term maintenance of rat taste cells in culture. Chem. Senses. 31, 279-290 (2006).
- Ozdener, M. H., Brand, J. G., Spielman, A. I., Lischka, F. W., Teeter, J. H., Breslin, P. A., Rawson, N. E. Characterization of Human Fungiform Papillae Cells in Culture. Chem. Senses. 36, 601-612 (2011).
- Gomez, G., Rawson, N. E., Hahn, C. G., Michaels, R., Restrepo, D. Characteristics of odorant elicited calcium changes in cultured human olfactory neurons. J. Neurosci. Res. 62, 737-749 (2000).
- Wolozin, B., Sunderland, T., Zheng, B. B., Resau, J., Dufy, B., Barker, J., Swerdlow, R., Coon, H. Continuous culture of neuronal cells from adult human olfactory epithelium. J. Mol. Neurosci. 3, 137-146 (1992).
- Wick, N., Saharinen, P., Saharinen, J., Gurnhofer, E., Steiner, C. W., Raab, I., Stokic, D., Giovanoli, P., Buchsbaum, S., Burchard, A., Thurner, S., Alitalo, K., Kerjaschki, D. Transcriptomal comparison of human dermal lymphatic endothelial cells ex vivo and in vitro. Physiol. Genomics. 17, 179-192 (2007).
- Fu, L., Zhu, L., Huang, Y., Lee, T. D., Forman, S. J., Shih, C. C. Derivation of neural stem cells from mesenchymal stemcells: evidence for a bipotential stem cell population. Stem Cells Dev. 17, 1109-1121 (2008).
- Sandow, S. L., Grayson, T. H. Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 297, H1-H7 (2009).
