Isolering og dyrkning af humane Fungiform Taste papiller Celler
Summary
Vi havde til formål at udvikle en reproducerbar protokol til at isolere og opretholde langsigtede kulturer af humane fungiform smag papiller celler. Celler fra menneskelige fungiform papiller opnået ved biopsi blev med succes holdt i kultur i mere end otte passager (12 måneder) uden tab af levedygtighed.
Abstract
Smag celler er meget specialiseret, med unikke histologiske og molekylære og fysiologiske egenskaber, der tillader detektion af en lang række simple stimuli og komplekse kemiske molekyler indeholdt i fødevarer. I humant individuel fungiform papiller indeholde fra nul til så mange som 20 smagsløg. Der er ingen etableret protokol for dyrkning af humane smag celler, selv om evnen til at opretholde smagen papiller celler i kultur til flere cellecykler ville være af stor nytte til karakterisering af de molekylære, regenerative og funktionelle egenskaber af disse unikke sensoriske celler. Tidligere undersøgelser af smag celler er blevet udført under anvendelse af frisk isolerede celler i primær kultur, eksplantatkulturer fra gnavere eller semi-intakte smagsløgene i vævssnit 1,2,3,4. Selv om hver af disse præparater har fordele, vil udviklingen af langsigtede kulturer har givet betydelige fordele, især for studier af smag celledeling og forskelrentiation. Flere grupper, herunder vores, har været interesseret i udvikling og etablering af smag cellekulturmodeller. De fleste forsøg på kultur smag celler har rapporteret begrænset levedygtighed, med celler typisk ikke længere varighed end 3-5 d. 5,6,7,8. Vi har for nylig rapporteret om en succesfuld metode til den udvidede kultur af gnaver smag celler 9. Vi her rapport første gang etableringen af en in vitro-kultur system til isolerede humane fungiform smag papiller celler. Celler fra menneskelige fungiform papiller opnået ved biopsi blev med succes holdt i kultur i mere end otte passager (12 måneder) uden tab af levedygtighed. Celler viste mange molekylære og fysiologiske egenskaber karakteristiske for modne smag celler. Gustducin og phospholipase C β2 (PLC-β2) mRNA blev detekteret i mange celler ved revers transkriptase-polymerasekædereaktion og bekræftet ved sekventering. Immuncytokemi analyse viste tilstedeværelsen af vindstødducin og PLC-β2-ekspression i dyrkede smag celler. Dyrkede humane fungiform celler udviste også stigninger i intracellulært calcium som reaktion på passende koncentrationer af forskellige smag stimuli indikerer, at smag receptorer og i det mindste nogle af de signalveje var til stede. Disse resultater indikerer, at en tilstrækkelig smag celler fra voksne mennesker kan genereres og opretholdes i mindst otte passager. Mange af cellerne bevarer fysiologiske og biokemiske karakteristika for akut isolerede celler fra den voksne smag epitel at støtte deres anvendelse som en model smag system. Dette system vil gøre det muligt for yderligere undersøgelser af de processer, der er involveret i proliferation, differentiering og funktion af pattedyr smag receptor celler i en in vitro præparat.
Menneskelig fungiform smag papiller anvendes til oprettelse af human fungiform cellekultur blev doneret til forskning efter en fyldestgørende informeret samtykke under forsknings-protokoller, der blev revideretog godkendt af IRB-udvalget. Protokollen (# 0934) blev godkendt af Schulman Associates Institutional Review Board Inc., Cincinnati, OH. Skrevet protokol nedenfor er baseret på offentliggjorte parametre rapporteret af Ozdener et al. 2011 10.
Protocol
Discussion
Vi har fastholdt celler fra menneskelige fungiform smag papiller for over 8 passager, spænder over en periode på 12 måneder. Disse kulturer skaber nye celler, hvoraf mange modnes in vitro til den fase, hvor de udtrykker flere markører for modne smagsløg celletyper, foruden vigtige molekylære og fysiologiske egenskaber smag receptor celler. Tilstedeværelsen af gustducin-og PLC-β2-immunoreaktivitet i delmængder af dyrkede celler er i overensstemmelse med denne konklusion. Vigtigst er det, nogle cel…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Aimee Myers og Esi Quayson for tekniske kvalifikationer og hjælpe. Dette arbejde blev delvist støttet af NSF 0216310 og Givaudan Inc tilskud (NER).
Materials
| Name of the reagent | Company |
| MCDB 123 | Sigma-Aldrich |
| Iscove’s DMEM Medium | MediaTech |
| Elastase | Sigma-Aldrich |
| Pronase E | Sigma-Aldrich |
| Elastase | Worthington |
| Soy bean trypsin inhibitor | Worthington |
| Collagenase type 1 | Worthington |
| Rat tail collagen type 1 | BD Sciences |
| Fura-2 AM | Molecular Probes |
| Superscript First Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen |
| Leica TCS SP2 Spectral Confocal Microscope | Leica Microsystems Inc. |
| Discovery-1 imaging station and Metamorph software | Molecular Devices |
| Small fine-tip forceps and extra fine spring scissors | Fine Science Tools |
Referências
- Mbiene, J. P., Maccallum, D. K., Mistretta, C. M. Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia. J. Comp. Neurol. 377, 324-340 (1997).
- Miyamoto, T., Fujiyama, R., Okada, Y., Sato, T. Strain difference in amiloride-sensitivity of salt-induced responses in mouse non-dissociated taste cells. Neurosci. Lett. 277, 13-16 (1999).
- Caicedo, A., Jafri, M. S., Roper, S. D. In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells. J. Neurosci. 20, 7978-7985 (2000).
- Qin, Y. M., Shi, J. Q., Zhang, G. H., Deng, S. P., Wang, T. H. A reliable method to obtain cells of taste buds from fungiform papillae of mice. Acta Histochem. 112, 107-112 (2010).
- Spielman, A. I., Mody, I., Brand, J. G., Whitney, G., MacDonald, J. F., Salter, M. W. A method for isolating and patch-clamping single mammalian taste receptor cells. Brain Res. 503, 326-329 (1989).
- Kishi, M., Emori, Y., Tsukamoto, Y., Abe, K. Primary culture of rat taste bud cells that retain molecular markers for taste buds and permit functional expression of foreign genes. Neurociência. 106, 217-225 (2001).
- Ruiz, C. J., Stone, L. M., McPheeters, M., Ogura, T., Bottger, B., Lasher, R. S., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. Maintenance of rat taste buds in primary culture. Chem. Senses. 26, 861-873 (2001).
- Stone, L. M., Tan, S. S., Tam, P. P., Finger, T. E. Analysis of cell lineage relationships in taste buds. J. Neurosci. 22, 4522-4529 (2002).
- Ozdener, H., Yee, K. K., Cao, J., Brand, J. G., Teeter, J. H., Rawson, N. E. Characterization and long-term maintenance of rat taste cells in culture. Chem. Senses. 31, 279-290 (2006).
- Ozdener, M. H., Brand, J. G., Spielman, A. I., Lischka, F. W., Teeter, J. H., Breslin, P. A., Rawson, N. E. Characterization of Human Fungiform Papillae Cells in Culture. Chem. Senses. 36, 601-612 (2011).
- Gomez, G., Rawson, N. E., Hahn, C. G., Michaels, R., Restrepo, D. Characteristics of odorant elicited calcium changes in cultured human olfactory neurons. J. Neurosci. Res. 62, 737-749 (2000).
- Wolozin, B., Sunderland, T., Zheng, B. B., Resau, J., Dufy, B., Barker, J., Swerdlow, R., Coon, H. Continuous culture of neuronal cells from adult human olfactory epithelium. J. Mol. Neurosci. 3, 137-146 (1992).
- Wick, N., Saharinen, P., Saharinen, J., Gurnhofer, E., Steiner, C. W., Raab, I., Stokic, D., Giovanoli, P., Buchsbaum, S., Burchard, A., Thurner, S., Alitalo, K., Kerjaschki, D. Transcriptomal comparison of human dermal lymphatic endothelial cells ex vivo and in vitro. Physiol. Genomics. 17, 179-192 (2007).
- Fu, L., Zhu, L., Huang, Y., Lee, T. D., Forman, S. J., Shih, C. C. Derivation of neural stem cells from mesenchymal stemcells: evidence for a bipotential stem cell population. Stem Cells Dev. 17, 1109-1121 (2008).
- Sandow, S. L., Grayson, T. H. Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 297, H1-H7 (2009).
