Çekirdek biyoanalizlerin kullanarak Fungal Kolonizasyon, Sporogenesis ve Mikotoksin Üretimi Kantitasyonu
Summary
Tohum bulaşmasını mantarlar tarafından tahılların yıkım daha iyi bitki-patojen etkileşimleri anlamak için sayısız araştırma çabaları açtı. Bir laboratuvar ortamında tohum-mantar etkileşimleri çalışmak için, mantar üretimi, biyokütle, ve çekirdek biyoanalizlerin kullanarak mikotoksin kontaminasyonu ölçümü için sağlam bir yöntem geliştirdi.
Abstract
Tarafından tahıl çürüyen tohum bulaşmasını mantarların insan ve hayvan sağlığı için ciddi riskler söz değil, tahıl üretimini dünya çapında büyük ekonomik mücadelelerinden birisidir. Tahıl üretimi arasında, mısırın tahıl bütünlüğü ve mikotoksin tohum kontaminasyon patojen kaynaklı zararlar nedeniyle, belki de en çok etkilenen üründür. Mısırdan yetiştiricileri ve gıda ve yem işlemciler için iki en yaygın ve sorunlu mikotoksinler sırasıyla Aspergillus flavus ve Fusarium verticillioides tarafından üretilen aflatoksin ve fumonisin, vardır.
Moleküler bitki-patojen ilişkileri son yıllarda yapılan çalışmalara mantar enfeksiyonu ve mikotoksin kontaminasyonu 1,2,3,4,5,6 için bitki cevabı ile birlikte özel mekanizmalar anlamada umut göstermiştir. Birçok laboratuvar bitki-patojen ilişkileri incelemek için çekirdek testleri kullandığınızdan, farklı biyolojik parametreleri hesaplamak için bir standart yöntem için bir ihtiyaç, bu nedenle oradaFarklı laboratuvarlarda elde edilen sonuçlar çapraz yorumlanabilir. Tohumlar üzerinde kantitatif analiz için sağlam ve tekrarlanabilir araçlar için, mantar üremesi, biyokütle, ve mikotoksin kirliliği ölçmek için in-lab çekirdek testleri ve sonraki yöntemleri geliştirmişlerdir. Dört sterilize darı çekirdekleri bir fungal süspansiyon (10 6) ile cam şişe içinde aşılanmış ve önceden belirlenmiş bir süre boyunca inkübe edilir. Numune şişeleri daha sonra yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), bir AflaTest florimetre yöntemi kullanılarak aflatoksin miktar ve HPLC ile fumonisin kantifikasyon tarafından hemositometre, ergosterol tabanlı biyokütle analizi ile Konidyumların sayımı için seçilir.
Protocol
Discussion
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz onların teknik yardım Brandon Hassett ve Carlos Ortiz teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Dr Michael Kolomiets için NSF hibe İOK-0544428, IOS-0951272, ve IOS-0925561 tarafından desteklenen edildi ve Gıda ve Tarım USDA Ulusal Enstitüsü (NIFA), AFRI Bitki Yetiştirme ve Eğitim Bursu # 2.010-85.117 tarafından -20.539 DRS. Seth Murray, Thomas Isakeit ve Michael Kolomiets.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog # |
| Potato Dextrose Agar | Fisher Scientifc | S71659A |
| Tween-20 | Fisher Scientifc | BP337-100 |
| Plastic incubation container | Sterilite | 1713LAB06 |
| Blender | Vicam | 20200 |
| 24 cm Fluted Filter Papers | Vicam | 31240 |
| 1.5 μm glass microfibre | Vicam | 31955 |
| Afla Test column | Vicam | G1024 |
| Afrla Test Developer | Vicam | 32010 |
| Methanol | Vicam | 35016 |
| Acetonitrile | Fisher Scientifc | AC14952-0025 |
| Ethanol | Fisher Scientifc | AC39769-0025 |
| C-18 solid phase extraction column (Prep SEP SPE C18 Column) | Fisher Scientifc | 60108-304 |
| O-phthalaldehyde (OPA) | Sigma Chemical Co | 79760-5g |
| Boric acid | Fisher Scientifc | BP168-500 |
| Sodium borate | Fisher Scientifc | RDCS0330500 |
| Mercaptoethanol | Fisher Scientifc | 45-000-231 |
| Shimadzu HPLC LC-20AT (Pump) | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | LC-20AT |
| Zorbax ODS column (4.6x150mm) | Agilent Technologies | 443905-902 |
| Shimatzu RF-10Axl fluorescence detector | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | RF-10AXL |
| Sodium phosphate | Fisher Scientifc | AC38987-0010 |
| FB1 standards | Sigma Chemical Co. | F1147-1mg |
| Chloroform | VWR | MK444410 |
| 13 mm syringe filter with 0.45 um nylon membrane (HPLC) | Pall Life Science | 4426 |
| Ergosterol | Sigma-Aldrich | 45480-50G-F |
| Scintillation vials | VWR | 66021-602 |
| Sodium Chloride | Vicam | G1124 |
Referências
- Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals. Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).
- Gao, X., Shim, W. -. B., Göbel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M. Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 922-933 (2007).
- Brodhagen, M., Tsitsigiannis, D. I., Hornung, E., Goebel, C., Feussner, I., Keller, N. P. Reciprocal oxylipin-mediated cross-talk in the Aspergillus – seed pathosystem. Mol. Microbiol. 67, 378-391 (2008).
- Gao, X., Brodhagen, M., Isakeit, T., Brown, S. H., Göbel, C., Betran, J., Feussner, I., Keller, N. P., Kolomiets, M. V. Inactivation of the lipoxygenase ZmLOX3 increases susceptibility of maize to Aspergillus spp. Mol. Plant-Microbe Interact. 22, 222-231 (2009).
- Gao, X. Q., Kolomiets, M. V. Host-derived lipids and oxylipins are crucial signals in modulating mycotoxin production by fungi. Toxin Rev. 28, 79-88 (2009).
- Mukherjee, M., Kim, J. -. E., Park, Y. -. S., Kolomiets, M. V., Shim, W. -. B. Regulators of G protein signaling in F. verticillioides mediate differential host-pathogen responses on non-viable versus viable maize kernels. Mol. Plant Pathol. 12, 479-491 (2011).
- Zheng, M. Z., Richard, J. L., Binder, J. A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins. Mycopathologia. 161, 261-273 (2006).
- Bacon, C. W., Bennett, R. M., Hinton, D. M., Voss, K. A. Scanning electron microscopy of Fusarium moniliforme within asymptomatic maize kernels and kernels associated with equine leukoencephalomalacia. Plant Dis. 76, 144-148 (1992).
- Munkvold, G. P., Hellmich, R. L., Rice, L. G. Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Bt maize hybrids and nontransgenic hybrids. Plant Dis. 83, 130-138 (1999).
- Sagaram, U. S., Shaw, B. D., Shim, W. -. B. Fusarium verticillioides GAP!, a gene encoding a putative glycolipid-anchored surface protein, participates in conidiation and cell wall structure but not virulence. Microbiol. 153, 2850-2861 (2007).
- Shim, W. -. B., Flaherty, J. E., Woloshuk, C. P. Comparison of Fumonisin B1 biosynthesis in maize germ and degermed kernels by Fusarium verticillioides. J. Food Protect. 66, 2116-2122 (2003).
- Shim, W. -. B., Woloshuk, C. P. Regulation of fumonisin B1 biosynthesis and conidiation in Fusarium verticillioides by a cyclin-like (C-type) gene, FCC1. Appl. Environ. Micrbiol. 67, 1607-1612 (2001).
- Christensen, S. A. . Conversation with: Won-Bo Shim. , (2011).
- Shin, J. -. H., Shim, W. -. B. Characterization of PPR1 and PPR2, genes encoding regulatory subunits of protein phosphatase 2A in Fusarium verticillioides. Phytopathol. 99, S119 (2009).
- Breivik, O. N., Owades, J. L. Spectrophotometric Semimicrodetermination of Ergosterol in Yeast. Yeast. Agric. and Food Chem. 5, 360-363 (1957).
