1. הסבר של נוהל MFIA (איור 1) MFIA דורש אנטיגן קלקר microspheres של צ'ארלס ריבר המצופה (חרוזים), מבחן סרה, ריאגנטים כותרת (שקית, SPE) וחוצצים (ממס יסודי, מאגר Assay). החומרים כימיים נוספים שלבים לבארות של 96-גם צלחות microtiter המסננים תחתונות. MFIA מתבצע כincubations משמעות בדיקה הטרוגניות הם אחריו בצעדים מסננים לשטוף כדי להסיר מרכיבים לא כרוכים בסרום או שכותרת ריאגנטים. פתרון שטפים הוסיף לצלחת בארות יוסרה על ידי שאיפה דרך תחתית מסנן היטב, אשר שומרת את החרוזים. מבחני MFIA מבוצעים בטמפרטורת חדר (27 ° C + / -2 המעלות צלזיוס). קומפלקסי אנטיגן נוגדן שנוצרו במהלך שלב דגירת מבחן הסרום מזוהים על ידי incubations עם conjugates biotinylated העז נגד מינים (שקית) ואחרי streptavidin R-phycoerythrin מתויג-(SPE). בקורא assay, החרוזים עוברים אחד בכל פעם דרךגלאי שבו הם חשופים לשני לייזרים. ליזר אחד שמרגש את הצבעים הפנימיים שמזהים את מערך הצבע של החרוז, אשר תואם את הבדיקה, והשני מרגש את צבע כתב phycoerythrin נתפס במהלך הבדיקה. מספר קבועים מראש של חרוזים נקראים לבדיקה ועוצמת phycoerythrin פלואורסצנטי מדווחת כמדד קרינת חציונים (MFI). איור 1. נוהל MFIA. MFIA Xmap המבוסס הוא microarray השעיה אשר מנצל 5.6 חרוזי קלקר בצבעי מיקרון שאנטיגנים (או ביקורת) מקושרים קוולנטית. מאז החרוזים באים ב100 ערכות צבעים שונות, רבים כמו 100 מבחנים שונים ניתן לבצע בצעדי Assay גם בודדים מתבצעים בצלחות microtiter מסנן מלמטה, כדי שניתן לכבס חרוזים על ידי שאיפה בסעפת ואקום. תגובות שלהם לקרוא עם 100 fluorometer Xmap Luminex. עוצמת phycoerythrin פלואורסצנטי מדווח כמדד פלואורסצנטי החציונית (MFI) 2. לפני תחילת עבודה נא לב לדברים הבאים: חרוזי MFIA הם רגישים לאור להגביל את כמות אור החשיפה ישירה הוא קריטי. הכמות הנורמלית של חשיפה לאור המתרחשת במהלך בדיקות שגרתיות מקובלת אבל חשיפה ממושכת יכולה להוביל לphotobleaching של החרוזים ההופכים אותם לבלתי קריא על ידי קורא Assay. זה חיוני להצלחה של assay שחרוזי MFIA תמיד vortexed להשעיה ולאחר מכן sonicated (10-30 שניות) לפני שימוש. קורא Assay אוסף מידע מחרוזים בודדים בלבד. אשכולות חרוזים מצטברים יכולים להוביל יותר זמן לקרוא פעמים. הקפד לשמור את צלחת הבדיקה מכוסית במכסת הצלחת בכל הצעדים כדי למנוע אידוי הדגירה של פתרוני assay. ציוד מגן אישי הנדרשים: מעבדה מעיילת, GLoves, הגנה על עיניים צריכים להיות משוחקים בכל העת תוך כדי עבודה בסביבת מעבדה. 3. ריאגנטים הטבלה 1 כוללת את רוב החומרים הדרושים להקמת מעבדת MFIA בבית. פריטים נוספים או כפולים עשויים להיות נחוצים בהתאם לצרכימים הספציפיים שלך. שים לב שמלאי זה אינו כולל חומרים כימיים שנרכשו מצ'ארלס ריבר (חרוזי MFIA, בקרות וריאגנטים נוספים). כמה מקורות מסחריים של conjugates biotinylated וphycoerythrin מתויג streptavidin זמינים. עם זאת בריאגנטים הזמינים מצ'ארלס ריבר כבר טיטרציה להניב איתות האופטימלית לניקוד רעש עם חומרים כימיים שלנו, תוך שימוש בספקים חלופיים או מגרשים מגיבים אינה מומלצת. טבלת 1. CR-RADS משתמש Reader מערך ההשעיה BioPlex מBioRad ומכונת כביסת microplate אוטומטית מBioTek. מכשור שווה ערך זמין מספקים חלופיים. <tbody> פריט מוכר מספר קטלוגים ציוד קורא מערך השעיה * BioRad 171-000205 96-גם מכונת כביסת microplate BioTek ELX50/8FMW שואב קולי / אמבטיה הקול פאלמר EW0884900 מיקסר אנלוגי מערבולת VWR 58816-121 -20 ° C מקפיא שונה 4 ° C מקרר שונה ערוץ 12-pipettor, 20-200μl VWR 83009-718 Orbital הצלחת שייקר VWR / מעבדת קו 57019-600 פיפטורים ערוץ יחיד, 20-200μl, עם טיפים VWR 83009-732 פיפטורים מסך, 2-20μl, עם טיפים VWR 83009-726 פיפטורים ערוץ יחיד, 100-1000μl, עם טיפים VWR 83009-736 מכשיר האוורור Vacushield VWR 55095-006 משאבת לחץ ואקום VWR 54908-037 מאגר פסולת מערכת ואקום VWR 80200-640 Disposables צלחת polystryrene 96-היטב הפישר סיינטיפיק 14-245-145 Multiscreen HTS-BV צלחת, 1.2μm מסנן, סטירן Millipore MSBV N12 50 15 מיליליטר צינורות חרוטים (פוליפרופילן) Sarstedt 62554.002 50 מיליליטר צינורות חרוטים (פוליפרופילן) Sarstedt 62547.004 בקבוקוני סרום Sarstedt 72694.007 רדיד אלומיניום VWR 89079-068 בקבוקי 1 ליטר, סטרילי VWR 28199-246 מסנני 0.22μm בקבוק עליון VWR 28199-307 מאגרים מגיבים (100 מ"ל) VWR 82026-356 5 מ"ל, 10 מ"ל, pipets 25ml לניפוק ריאגנטים נוזליים VWR ריאגנטים PBS, pH 7.4 1 BSA, אבקה (שקיות) סיגמא P3813 ProClin 300 סיגמא / Supelco 48912-U ללא ציפוי microspheres Luminex השתנה בהתאם לסוג 4. הכנת ריאגנט שני חוצצים נדרשים להליך MFIA. הממס ראשוני הוא זמין מצ'ארלס ריבר ומכיל סוכני חסימת קנייניות כדי להקטין אינטראקציות חלבון שאינם ספציפיות. חיץ לשטוף assay נעשה במתקן שלך עם חומרים כימיים מסחרי קיימים. Assay לשטוף חיץ: 1% חומציות PBS / BSA 7.4 זמין כאבקה מסיגמה אולדריץ. ההסרה של חלקיקים על ידי סינון היא קריטית כמו חלקיקים אלה יכולים להוביל לסתימות בקורא assay. סנן החיץ דרך בקבוק עליון יחידת מסנן 0.2micron ל, מכולות סטריליים שכותרתו. התיק וSPE בדילול לריכוז עבודת 2X בחיץ לשטוף Assay. הערה: SPE הוא רגיש לאור וshולד יש חשיפת אור מוגבלת. 5. לדוגמא הכנה להרכיב חומרים שלך לבדיקה, ריאגנטים והציוד מתכלה. micropipettes וטיפים Multi-וערוץ אחד צלחות גם 96-נמוכות חלבון מחייבות microtiter (דילולי סרום) וצלחות מסננות תחתונות (assay MFIA) איסוף דגימות דם לפי הנוהל הרגיל שלך. לאפשר את דגימות הדם להיקרש באופן מלא על ידי החזקתן בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות לפחות לפני צנטריפוגה והסרת סרום. סרום Undilute יש vortexed בקצרה לערבב את המרכיבים לפני דגימת הדם. דילול הבדיקות הסופית לMFIA הוא 1/50. זה הכרחי כדי להפוך את מדגם 2X (1/25) של סרום הבדיקה שלך לבדיקה. דלל את סרום מבחן דילול המלא על ידי הוספת חלק 1 סרום לממס 24 חלקי MFIA ראשי. ארגון סרום הבדיקה שלך בצלחת microtiter 96-גם מקטין באופן משמעותי את זמן העברת הדגימות שלך לtesצלחת ולא מומלצת בחום. 6. הכנת צלחת מבחן הרטבת Pre-96-מבחן הצלחת גם נדרשה כדי להבטיח, גם כן פינוי ראוי. גם אם כל הצלחת לא ישמש צעד זה נדרש בתחילה, אתה לא צריך להוסיף מגיב או לאחר מכן לשטוף חיץ לבארות הריקות. מעבדות החלק להפעיל פחות מצלחת מלאה 96-היטב על ידי אטימת בארות שאינן בשימוש על צלחת הניסוי והתכנית לחזור ולהשתמש בארות אלה במועד מאוחר יותר. אנו לא ממליצים על שימוש בשיטה זו משום שהיא עלולה להשפיע על הסינון הנכון של צלחת הבדיקה. שאיפת צלחת מבחן ראויה היא חיונית להצלחה של assay MFIA. פינוי בארות המדגם צריך לקחת כ 5-10 שניות. Aspirating את התוכן גם במהירות רבה מדי יכול להוביל לצבירת חרוז וזמנים לקרוא איטיים בסוף הבדיקה. תמחה התחתון של צלחת בדיקה עם מגבות נייר לאחר כל wצעד אפר כדי להבטיח ניקוז נוזל הפסיק. אי ימחה את צלחת הבדיקה יכול להוביל לריאגנטים נוזליים פתילה מתוך את הבארות במהלך דגירה ותוצאה באי מינים אנטי עיזים ועשרות מיני IgG חרוז / או. חרוזים אלה נועדו לציון בטווח שנקבע מראש MFI כאשר הכמות המתאימה של סרום עיקרי וריאגנטים התוויות נוספות לכל גם. 7. הכנת השעית חרוז MFIA זה חיוני להצלחה של assay שהחרוזים תמיד vortexed וsonicated לפני השימוש. קורא assay אוסף מידע מחרוזים בודדים בלבד, אגרגטים או גושי חרוזים יכולים להוביל לעוד לקרוא פעמים. מערבולת המניות יחד השעית חרוז (בדרך כלל 10 ± 5 שניות) Resuspend את החרוזים אחרי sonication באמבט sonicator ל10-20 שניות. לדלל את השעית מניית 20X להשעית חרוז 2X עובד בממס ראשית. לוותר 50μl של השעית חרוז 2Xלכל assay גם של פלייט המבחן מראש הרטוב. 8. תוספת של סרה בדיקה ובקרה לבדיקת פלייט פיפטה 50μl כל בדיקה ובקרת סרום לצלחת המבחן המבוססת על מפת הצלחת המוגדרת מראש שלך 2X. מכסה מאובטח לצלחת עם גומייה או נייר אלומיניום ודגירת פלייט המבחן ל60minutes בהקפת שאכר, בחושך בטמפרטורת חדר. המהירות שייקרה צריכה להיות גדולה מ 400 אך פחות מ 700rpm. זה קריטי, כי החרוזים יישמרו בהשעיה כדי לאפשר לנוגדנים בסרום לגשת לכל המשטחים של אנטיגנים יחד. כישלון לשמור על החרוזים מושעים יגרום ציונים נמוכים בקרת IgG חרוז והבדיקה תהיה צורך לחזור. 9. כביסת פלייט המבחן לשאוב את התוכן גם באמצעות סעפת ואקום. פינוי בארות המדגם צריך לקחת כ 5-10 שניות. תמחה תחתון של צלחת הבדיקה עם Papeמגבות r לאחר כל כדי להבטיח ניקוז נוזל הפסיקו. Resuspend את החרוזים ב50μl של חיץ לשטוף Assay. חשובים שהחרוזים אינם מורשים יתייבשו במהלך תהליך הבדיקה. 10. הוספת תיק וSPE לצלחת המבחן לוותר 50μl תיק של דילול עובד 2X לכל הבארות המכילות חרוזי MFIA. לאבטח את המכסה לצלחת עם הגומייה או נייר אלומיניום. דגירת צלחת המבחן ל30minutes עם רועד כאמור לעיל, בחושך בטמפרטורת חדר. לאחר הדגרה זה לשטוף את צלחת המבחן וresuspend את החרוזים עם חיץ לשטוף Assay כפי שתוארה קודם לכן בעקבות בנוסף סרום. לוותר 50μl של SPE הדילול עובד 2X לכל הבארות המכילות חרוזי MFIA. לאבטח את המכסה לצלחת עם הגומייה או נייר אלומיניום. דגירת צלחת המבחן ל30minutes עם רועד כאמור לעיל, בחושך בטמפרטורת חדר. לאחר incu זהbation לשטוף את צלחת המבחן וresuspend את החרוזים עם 125μl של חיץ לשטוף Assay ולנער את הצלחת ל~ שתי דקות לresuspend את החרוזים לפני הצבת לקורא assay. 11. קריאת פלייט המבחן הנח את צלחת המבחן לקורא assay תוך 10 דקות של resuspending את החרוזים. במקרה של הפסקת חשמל או אירוע אחר, פלייט המבחן יכול להיות מאוחסן בטמפרטורת חדר בחושך עד 12 שעות עד מוכן לקריאה. שים לב לדוגמא הראשונה גם כדי לוודא שפנל החרוז נבחר תואם את פרופיל החרוז בבארות הבדיקה. אם יש חרוזים נופלים מחוץ "אזור החרוז" המיועד שלהם בתצוגת הפרוטוקול, בחירת פרופיל נכונה נעשתה. אם את החרוזים כבר resuspended כראוי הם צריכים למלא ב'האזורים 'שצוינו מצוינים בתוכנת קורא assay. אם את החרוזים הם מגובשים הם ימלאו באזורים שלהם באיטישיעור. אתה יכול להסיר את צלחת הבדיקה מהקורא וידני resuspend את הבארות. כל Triturate היטב עם pipettor רב ערוצית 3-4 פעמים כדי לסייע בפירוק מצרפי החרוזים. החלף את צלחת המבחן לקורא ולהמשיך. 12. נציג תוצאות מספר מינימאלי של חרוזים נקראים לבדיקה ועוצמת phycoerythrin פלואורסצנטי מדווחת כמדד קרינת חציונים (MFI) נע בין 0 ל 32667. לאחר השוואת סעיפים של 25, 50 או 100 לחרוזים גם לא ראו שום הבדל סטטיסטי ובאופן שגרתי לספור 25 חרוזים לסוכן לדגימה היטב. בדוק את דוח התוצאות לשגיאות, כגון ספירת חרוזים לקויה או נכשל ציונים נגד IgG חרוזי IgG /. חרוזים אלה נועדו "ציון" בטווח MFI שנקבע מראש, כאשר הכמות המתאימה של סרום עיקרי וריאגנטים התוויות נוספות לכל גם. בארות לדוגמה, עם טעויות (ספירת חרוזים נמוכה) או תוצאות כושלות IgG בקרת חרוזים צריכיםיחזור על עצמו לרכוש תוצאות תקפות. לייצא את התוצאות לגיליון עבודה של Excel. לנתונים לפרשנות שלנו כל assay מוקצה: רקמות בקרה של ניסוי (TC): עבור רוב מבחני MFIA מכרסמים, שליטת הרקמה היא תמצית של תאי חרקי סוג פראי baculovirus-נגועים. מפסק Assay: ערך זה הוא את הקרינה המינימאלית הצפויה ומותאם לכל assay כדי למקסם את דיוק אבחון. עבור רוב המבחנים, הפסקת פלואורסצנטי היא 3000. אינדקס קרינת חציונים נקי (MFI) מחושב לכל בדיקה (למעט בדיקות IgG בקרה ורקמות) על ידי הנוסחא הבאה. במילים אחרות, את אות הבדיקה הספציפית היא הבדיקה הכוללת MFI מינוס TC (רקע) MFI אז ערך זה מחולק על ידי 1000 שפשוט מגדיר את הטווח של בין 0-32 MFI הנקי במקום 0-32,667. נקי MFI = (Assay MFI נוגדן – בקרת רקמות MFI) / 1000 Neלא MFI וTC MFI מומרים לציונים בהשוואה למפסק Assay הספציפי לכל אנטיגן. איור 2. נתונים מייצגים MFIA למבחן סרום עם כל IgG שולט חולפים. 12.4 פרשנות MFIA תוצאות בדיקת פלייט יש לפרש רק אם מערכת הבקרה-התאמה ובקרת סרום (IgG / חרוזים אנטי IgG) תוצאות עומדות בקריטריונים לקבלה המפורטים בטבלה 2. כישלון של שני חרוזי בקרת IgG האלה יכול להצביע על כמה טעויות פרוצדורליות כגון דילול לא נכון או הצמוד נפח מספיק או דילול SPE, בלתי נאות בדיקת סרום או שימוש בסרום מחית immunocomprimised. טבלה 2 קריטריוני קבלה לבקרת Assay לשלוט </td> תוצאה מקובלת ציון מיון טווח גבוה חיסוני סרום ≥ 4.5 חיובי טווח נמוך חיסוני סרום ≥ 1.5 ≥ גבולי סרום ללא חיסון <2.5 ≤ גבולי Diluent <2.5 ≤ גבולי איג חרוז גדר * ≥ Cutoff/1000 לעבור * חרוז להגדיר מצופה באימונוגלובולינים ספציפיים למין אנטי מבחן סרום (איג): ציונים כושלים לשליטה התאמת מדגם זה יכולים להיגרם כתוצאה מתוספת של מדגם מספיק, גבוה מדי דילול מדגם, מינים שגויים או סרום מבדיקות הו immunodeficientst. אם כל אחד מפקדי Assay פלייט הבדיקה להיכשל מלבד הסרום חיסוני הטווח הגבוה, התוצאות הן לא מקובלות ויש לחזור. ציון עובר נמוך טווח סרום בקרה הוא קריטי שכן הוא מדגים את רמת רגישות זיהוי של צלחת הבדיקה. ציון עיזים אנטי מיני IgG החרוז מבוסס על כמות סרום מבחן עיקרי נוספת לבדיקה. אם שליטת חרוז זה נכשל אבל מיני IgG עובר (טוב B1, איור .3) אז זה מצביע על כך שחומרים כימיים בדיקה מספיק (שקית, SPE) נוספו למבחן היטב וזה נושא קשור בסרום. אם כמות ריאגנטים בדיקה אינה מספיק מסוים גם הוא IgG וחרוזי בקרה אנטי IgG ייכשלו (טוב E1, איור .3). איור 3. נציג תוצאות MFIA בדיקה עם כישלונות (שצוין בכתום). הוולס A1, C1 ו F1 מצביעים על כשל TC (reactive רקמה)בי ציון TC מיוצג בסוגריים. הוולס B1 ו E1 להמחיש את שני סוגים של כשלי IgG בקרה הפנימיים, בדיקת נוגדנים מספיקים (B1) או ריאגנטים בדיקה (E1) בהתאמה שקית / SPE. אם תוצאות בדיקת בקרת Assay פלייט הן משביעי רצון, ציוני assay פרט מסווגים, כפי שמוצגים בטבלה 3. זה קריטי כדי לאשר כל ממצא גבולי או חיובי, על ידי שיטת בדיקה חלופית. טבלה 3 סיווג ציון MFIA ציון מיון TC נקי TC + * נקי ≥ 2 <0.5 <2.5 שלילי (-) <td> ≥ 0.5 ≥ 2.5 תגובת TC (ט) <2 שלילי
