마우스 Dopaminergic 및 3 차원 콜라겐 매트릭스 Assays의 Striatal Explants의 해부와 문화
Summary
midbrain의 도파민 시스템과 striatum에서 Explants가를위한 콜라겐 매트릭스 분석에 사용됩니다<em> 체외에서</emmesostriatal 및 striatonigral 경로 개발> 분석. 본 분석에서는 axonal 파생물 및지도는 조작과 계량 수 있습니다. 그것은 또한 다른 지역이나 분자 단서를 평가에 대해 수정할 수 있습니다.
Abstract
striatum 한 포함한 telencephalon 여러 분야에 대한 중간 forebrain 번들 통해 Midbrain의 도파민 (mdDA) 뉴런 프로젝트. 서로, striatonigral (직접) 경로를 야기할 striatum에서 매체 가시 뉴런은 substantia nigra 2 신경을 분포시키다. 이러한 축삭의 책자의 개발은 축삭의 성장과 neurites하거나 (중급) 대상 지역 3,4에 의해 출시되는 분자를 포함하여지도 단서의 과다의 조합 동작에 의존적일 수 밖에 없습니다. 이러한 수용성 요소는 세포외 환경을 흉내낸 axons에 대한 입체적인 기판을 제공하는 콜라겐 매트릭스의 culturing의 mdDA 및 / 또는 striatal explants하여 체외에서 공부하실 수 있습니다. 또한, 콜라겐 매트릭스 주변 (예 : 참고 문헌 5와 6 참조)에 배치 기타 explants이나 세포가 발표한 단백질의 상대적으로 안정적인 그라디언트의 형성을 허용합니다. 여기 pur를위한 방법을 설명콜라겐 젤류 및 후속 immunohistochemical 및 정량 분석에 쥐의 꼬리 콜라겐, dopaminergic 및 striatal explants의 microdissection, 그들의 문화 ification. 첫째, E14.5 마우스 배아의 두뇌는 고립된 dopaminergic이며 striatal explants는 microdissected됩니다. 이러한 explants 그 후 (CO) 체외에서 48~72시간 동안 coverslips에 콜라겐 젤에 배양해 있습니다. 그 후, axonal 전망이의 연결을 표시 (예, 티로신 hydroxylase, DARPP32 또는 βIII의 tubulin)과 축삭의 성장과 매력적이거나 혐오스러운 장면 축삭 댓글의 계량하고 사용하여 시각입니다. 이것의 연결 준비는 개발하는 동안 mesostriatal 및 striatonigral 축삭의 성장과지도의 세포와 분자 메커니즘의 체외 연구에 대한 유용한 도구입니다. 이러한 분석을 사용, 그건 dopaminergic 및 striatal axons 기타 (중급) 목표를 평가하기 위해 또는 특정 분자 단서를 테스트할 수도 있습니다.
Protocol
Discussion
콜라겐 매트릭스 분석은 여기 설명 (예 : 참고 문헌 5-8 참조) 축삭 유도 분자와의 연결 시스템의 다양한 조사를 위해 지난 수십 년간의 여러 연구소에서 사용하고 향상되었습니다. 이러한 연구는이 분석은 효과와 다른 (중급) 대상 조직을 통해 분비 축삭 유도 분자 규제를 공부를위한 강력한 도구입니다 것으로 나타났습니다.
그러나, 그것은 콜라겐 매트릭스가 세포외 환경 (E…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
콜라겐 매트릭스 분석은 과거 2-3 년 동안 여러 연구 그룹의 연구에 의해 개발되고 향상되었습니다. dopaminergic 및 striatal explants를 위해 여기에서 설명한 방법은 크게 이러한 연구로부터 혜택을 누릴 수 있습니다. 또한, 저자 striatal explant 문화를 설정하는 그녀의 도움을 Asheeta 프라 사드 감사드립니다. 실험실에서 작품은 인간 국경 과학 프로그램기구 (경력 개발 상)에 의해 추진하는 사업, 보건 연구 및 개발에 네덜란드기구 (ZonMW-VIDI 및 ZonMW-TOP), Europanian 연합 (mdDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , 그랜트 222999) (RJP까지) 및 학술 연구에 대한 네덜란드기구 (TopTalent; .. 너까지).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fetal Calf Serum | BioWhittaker | 14-801F | |
| Glutamine (200mM) | PAA | M11-004 | |
| Hepes | VWR International | 441476L | |
| β-Mercaptoethanol | Merck | 444203 | |
| Minimum Essential Media (MEM) | Gibco | 61100-087 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Gibco | 11415-049 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132660 | |
| Rabbit anti-Tyrosine Hydroxylase | Pel-Freez | P40101-0 | |
| Rabbit anti-Darpp32 (H-62) | Santa-Cruz | Sc-11365 | |
| Mouse anti-βIII tubulin | Sigma | T8660 | |
| Alexa Fluor labeled secondary antibodies | Invitrogen |
Referências
- van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. Getting connected in the dopamine system. Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).
- Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298, 1959-1964 (2002).
- Chilton, J. K. Molecules mechanisms of axon guidance. Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system. Nature. 336, 775-778 (1988).
- Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting. J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).
- Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem. J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).
- Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum. J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).
- De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).
