Kilitli Nükleik Asit Sitometrisi-floresan Yerinde Hibridizasyon (LNA akış FISH): Bakteriyel Küçük RNA Algılama Yöntemi

1. LNA probları ve deneysel tasarım Transkripsiyonu Srna / mRNA ters tamamlayıcı ya da onlara özel tasarlanmış Tasarım LNA probları www.exiqon.com . Eğer özel bir tasarım seçeneği kullanarak, sırası biliyorum, ama LNA spike desen değil. T m arasında değişen bir artış DNA veya RNA oligonükleotid sonuçları her LNA kalıntı yanı sıra iki ve 10 ° C LNA-RNA hibridizasyon dubleks 14. İdeal olarak, tasarlanan LNA probları, uzunluğu 20-25 nükleotidler (uzun probları sentezlemek için daha zordur) arasında olmalı ve T m ° C arasında 85-90 RNA hibridizasyon olmalıdır . Dizisi tasarladıktan sonra, BLAST kullanımlı http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi veya prob sadece Srna / ilgi mRNA özgü olduğundan emin olmak için yerel veritabanı prob dizisi karşılaştırmak. LNA prob sipariş ederken, LNA oligonükleotid 5 'uç bir biotin-TEG değişiklik ekleyin. Biyotinilasyon streptavidin-boya konjuge post-hibridizasyon boyama için gerekli. 3. Bu değişiklik eklemek mümkün 'gerekirse sonu, ancak' son 5 için ek daha az pahalı ve daha yüksek verim sonuçlanması gerekiyor. Üç negatif kontroller yöntemi dahil edilmelidir: (i) LNA prob hibridizasyon adım sırasında eklenen olduğu bir 'hayır LNA kontrolü, (ii)' boya 'kontrol LNA prob melezleşmiştir hedef Srna ama hibridizasyon olay floresan leke olmaması nedeniyle tespit ve (iii) 'olmayan ifade Srna / mRNA' kontrolü için bir olmayan veya non-ifade Srna hedefleyen bir LNA prob kullanan değil non-spesifik hibridizasyon izlemek için. Burada belirli bir LNA prob (LNA monomerlerin Srna CsrB tamamlayıcı ve '5'-biotin-TEG-gTccAttTccCgtCctTagCagC-3 dizisi varharfleri büyük). -20 ° C'de 10-20 mcL alikotları nükleaz içermeyen su ile tekrar süspansiyon 50 mg / ml ve mağaza liyofilize LNA alınmasından sonra Çözümler % 8 paraformaldehye (PFA), PBS içinde% 10 asetik asit: Mix 1 ml% 32 pfa, 400 mcL asetik asit, 400 mcL 10X PBS, pH = 7.4 ve 2.2 mL nükleaz içermeyen su. Dondurulmuş alikot için, -20 ° C'de asetik asit olmadan tek kullanımlık alikotları dondurma. % 60 dekstran sülfat çözeltisi: 50 ml konik boru 6.0 g dekstran sülfat ekleyin ve son hacim 10 ml su ekleyin. Dekstran sülfat eriyene kadar (1-2 saat sürebilir) bu karışıma bir su banyosunda 65 ° C ısıtın. İlave su, 10 ml hacmi korumak için çözünürleştirme süreci boyunca eklenmesi gerekir. Kısım, kullanılıncaya kadar -20 ° C'de% 60 dekstran sülfat çözeltisi ve mağaza. 2. Tespit Hasat 1×10 bioluminescent, 8 hücre <em> Vibrio campbellii veya bakteri ilgi ve 1.5 mL mikrosantrifüj tüp içine aktarabilirsiniz. Bu miktar hücre dört akış FISH örnekleri (belirli bir LNA prob örneği ve üç negatif kontroller) için yeterli başlangıç ​​materyali sağlar. Ek 1.5 mL mikrosantrifüj tüp alikotları diğer Srna / mRNA türleri test edilmesi gerekiyorsa alınmalıdır. Pelet, beş dakika boyunca 2300 xg santrifüj yoluyla bakteri hücrelerinin. Pipetleme süpernatantı atın ve 1X PBS 400 mcL hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. Bu karışıma, (1X PBS) çözümü tamponlu tuz iyice karıştırın 400 mcL 1X fosfat,% 8 paraformaldehye (PFA) ve% 10 asetik asit, 25, 10 dakika boyunca inkübe ° C beş dakika sonra bir kez karıştırma. Aksi belirtilmediği sürece tüm inkubasyon, ısıtılan bir tüp tutucu yapılmaktadır. Pfa çözelti taze olarak hazırlanır veya asetik asit ilave edildikten sonra dondurulmuş alikot kullanılmalıdır gerekir. Paraformaldehit crosslinking fiksatif bu helps korumak hücre morfolojisi ve hücre içi RNA korumak için. Pelet, iki dakika boyunca 4500 xg santrifüj bu karışım hücreleri ve pipetleme süpernatant kaldırmak. Santrifüj gerektiren tüm gelecekteki adımları aynı ayarları (7K, 2 dak.) Kullanmanız gerekir. Süpernatantlar pipetleme ve şişeden kaldırılması gerektiğini aşağıdaki santrifüj dikkat etmek önemlidir. Hücreler 400 mcL 1X PBS ile iki kez yıkayın ve 400 mcL 1X PBS nihai hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. Hücreler artık sabit ve 4 ° C 400 mcL 1X PBS yedi gün kadar saklanabilir. 3. Dietil pyrocarbonate tedavisi 1X PBS (400 bu çözüm, mcL buna göre ölçekli test edilecek her bir örnek için gereklidir) dietil pyrocarbonate (DEPC)% 0,1 çözüm 400 mcL hazırlayın. DEPC çözüm DEPC bir stok taze olarak hazırlanması gerekir. DEPC tedavi carbethoxylation RNases inaktive ve azalırarka plan sinyali. Pipetleme tarafından her sabit bakteri hücre örneği için% 0.1 DEPC çözüm 400 mcL ekleyin ve iyice karıştırın. Bu karışımı 12 dakika boyunca 25 ° C'de inkübe edin. 400 mcL 1X PBS, pelet hücreleri (7K, 2 dk) ile iki kez yıkayın ve hücrelerin süpernatantı kaldırmak. 4. Permeabilization Lizozim, 1.0 mg, 1.0 mg / ml çözümü için 1 ml Tris-EDTA tamponu (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) ekleyin. Bu çözüm, taze olarak hazırlanması gerekir. 25 800 hücrelerine 1 mg / ml lizozim çözüm mcL pipetleme ile iyice karıştırın ve inkübe ° C ile 30 dakika boyunca zaman zaman karıştırma. Pelet hücreleri (7K, 2 dk) ve süpernatant kaldırmak. Lizozim bakteri hücre duvarları peptidoglikan mevcut hidrolize permeabilization reaktif olarak görür. TE tamponunda proteinaz K 3.0 mcg / mL solüsyon hazırlayın. Bu çözüm, -20 ° C'de saklanan bir 20 mg / ml proteinaz K stok taze hazırlanmalıdırProteinaz K çeşitli proteinleri sindirir ve RNA probları ve reaktifler erişilebilirlik yardımcı bir serin proteaz. Pipetleme ile 3.0 mikrogram / ml proteinaz K çözümü hücre pelletini 800 mcL ekleyin ve iyice karıştırın. Inkübasyon yarısına vorteks ile 15 dakika boyunca 25 ° C'de inkübe edin. Pelet hücreleri (7K, 2 dak), süpernatant kaldırmak ve hücrelerin 400 mcL 1X PBS ile bir kez yıkayın. Yıkama süpernatant çıkardıktan sonra, 400 mcL 1X PBS hücrelerin tekrar süspansiyon ve dört yeni 1.5 ml mikrosantrifüj tüpler içine tabanda 100 mcL ekleyin. Pelet hücreleri (7K, 2 dk) ve süpernatant kaldırmak. 5. Melezleme Her bir örnek için hibridizasyon tamponu (HB) 100 mcL hazırlayın. HB, hacim, kütle olarak% 10 dekstran sülfat (her 100 mcL için 16,7% 60 dekstran sülfat çözeltisi mcL eklemek), 1X Denhardt çözümü, 50 mM sodyum fosfat pH değeri 7.0 ile% 50 formamid oluşur2X sodyum sitrat (SSC), makaslanmış somon sperm DNA (SSSD) ve 20 mg maya tRNA, 20 mg. HB bileşenleri her biri farklı bir amacı vardır. Formamid, böylece RNA denatürasyon ve hücre hasarını en aza indirmek yardımcı nükleik asit dublekslerden erime sıcaklığını düşürür. Dekstran sülfat hacim hariç polimer konsantresi ve prob hibridizasyon oranını artırmak için kullanılır. Denhardts çözüm, maya tRNA ve SSSD, non-spesifik bağlanma azaltmak için bir bloke edici ajanlar olarak hizmet. Tabanda içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüpler hücrenin her birinde 95 mcL Srna / HB ve 5.0 mcL eklemek mRNA özel LNA ya da su (LNA negatif kontrol için) [özel LNA final konsantrasyonu 20 pmol]. Örneğin: Tüp 1 – 95 mcL HB + 5.0 mcL Srna / mRNA özel prob Tüp 2 – 95 mcL HB + 5.0 mcL Srna / mRNA özel probu ('hiçbir boya' negatif kontrol) Tüp 3 – 95 mcL HB + 5.0 mcL Srna/ MRNA'nın prob ('non-ifade Srna / mRNA' negatif kontrol) Tüp 4 – 95 mcL HB + 5.0 mcL su ('hayır LNA' negatif kontrol) Dört örneğin 60 ° C'de 60 dakika inkübe edin. Hibridizasyon sıcaklığı LNA prob (ler) T m bağlıdır ve yaklaşık 30 ° C tavlama RNA T m tahmin altında. HB yükseltilmiş hibridizasyon sıcaklık ve formamid Her iki Srna veya ilgi mRNA ikincil yapı denatürasyon sağlar. 6. Post-hibridizasyon yıkar Hibridizasyon sonra,% 0.1 arasında-20 (SSCT) hibridizasyon karışıma 1,0 mL 0.1x SSC ekleyin. Bu hücrelerin viskoz hibridizasyon çözüm kaldırıldı izin vermek için gerekli. Pelet hücreleri (7K, 2 dk) ve süpernatant kaldırmak. % 50 formamid 200 mcL, 2X SSC,% 0.1 arasında-20 hücre pelletleri, iyice karıştırın ve incub30 dakika boyunca 65 ° C ısıtma bloğu yedik. 1 ml 0.1x SSCT ekleyin ve karışımı, pelet hücreleri (7K, 2 dak) süpernatantı kaldırmak. Hücrelerin tekrar süspansiyon haline getirin ve bir ısı bloğu içinde 40 dakika 65 ° C inkübe 500 mcL 0.1x SSCT ekleyin. Pelet hücreleri (7K, 2 dk) ve süpernatant kaldırmak. 7. Engelleme ve boyama (BB) engelleme tampon ve streptavidin-boya boyama çözüm hazırlayın. 5X stok (piyasada, Reaktifler bakınız) bir 1X BB çözüm hazırlayın. Dört tüplerin her set için 1.2 ml 1X BB hazırlamak. Hücre pelet, tekrar süspansiyon 200 mcL 1X BB ekleyin ve 30 dakika boyunca inkübe 25 ° C Streptavidin-konjuge boya biotinlenmiş LNA probları saptamak için kullanılır. Bloke ederken, 2 mcg / ml DyLight 488 streptavidin veya 30 dakika (üç örnekleri için, 300 mcL) 1X BB istenen boya streptavidin konjuge bir solüsyon hazırlanır. Incub sonra1X BB, pelet hücreleri (7K, 2 dk) ve süpernatant kaldırmak ation. Hücre pelletleri streptavidin-boya çözüm 50 mcL ekleyin, iyice karıştırın ve 12 dakika boyunca inkübe 25 ° C sabit bir girdap veya bir Thermomixer karıştırma. 'Boya' kontrol için, sadece 50 mcL 1X engelleme tampon ekleyin. Protokolün geri kalanı için, alüminyum folyo kullanarak ışık tüpleri korumak. 500 mcL 0.1x SSCT tampon hücreler ile bir kez yıkayın ve bir kez 400 mcL 1X PBS ile% 0.1 arasında-20 (PBST). Pelet hücreleri (7K, 2 dk) ve süpernatant kaldırmak. Ilk streptavidin-konjuge boyama ardından streptavidin-boya konjuge biotinlenmiş bir anti-streptavidin antikor tanıtan ve daha sonra ikinci kez (Şekil 2) melezleşmiş LNA prob başı sinyal çıkışı artırarak böylece streptavidin-boya ile boyanması, sinyal yükseltilir . 100 mcL ekleyin, 1 mcg / ml, anti-1X PBS, resuspen streptavidin antikor biotinlenmiş25 d hücreleri ve inkübe ° C ile 30 dakika boyunca zaman zaman karıştırma. Pelet hücreleri (7K, 2 dak), süpernatant kaldırmak ve 400 mcL 1X PBST ile iki kez yıkayın. 50 mcL 2 mcg / mL hücrelerin streptavidin-boya çözüm ekleyin, iyice karıştırın ve 12 dakika boyunca inkübe 25 ° C bir girdap veya bir Thermomixer sürekli karıştırma. 'Boya' kontrol için, sadece 50 mcL 1X engelleme tampon ekleyin. 500 mcL 0.1x SSCT tampon hücreler ile bir kez yıkayın ve bir kez 400 mcL 1X PBST. 4 200 mcL 1X PBST ve mağaza hücrelerin yeniden süspanse ° C akış sitometri analizi için hazır olana kadar. Küçük bakteri hücrelerinin çekirdek büyüklüğünü azaltmak için yavaş akış hızı ayarlayın. Buna ek olarak, forward scatter eşik kesilecek akış sitometrelerinde, kesim küçük bakteri hücreleri tespit sağlamak için mümkün olduğu kadar düşük olmalıdır. DyLight 488 tespiti için, akış sitometresinin, 488 nm lazer ve standart emisyon ile donatılmış olmalıdırFITC için filtreler. En az 2×10 4 olayları alınmalıdır. Diğer streptavidin-konjuge fluorophores farklı lazer ile donatılmış akış sitometrelerinde ile uyumluluk için, bu protokol için kullanılabilir. 8. Temsilcisi sonuçları Şekil 3A akım sitometri nokta arsa içinde, sabit ve etkin bir şekilde permeabilize hücrelerinin bir örnek gösterilmiştir . Permeabilization için yukarıda açıklanan koşullar kullanırken, hücre popülasyonu, küçük ve homojen gösteren birkaç hücre agrega. Lizozim yüksek konsantrasyonlarda (5 mg / ml) kullanıldığı zaman, hücreler agrega için daha sık ve daha büyük parçacıklar (Şekil 3B) göstergesi ileri artan dağılım değerleri göstermek. Başarılı bir LNA akış BALIK deney flow sitometri verileri bir örnek Şekil 4'te gösterilmiştir. Histogram üç negatif kontroller ile birlikte, belirli bir hedef Srna algılama gösteriyor.'Boya' negatif kontrol 'hayır LNA' ve 'olmayan ifade Srna' negatif kontrollerin ardından en floresan üretir. Son olarak, Srna özel LNA prob ile örnek büyük floresan üretir. Yöntem ve LNA sondalar bu şekilde doğrulandıktan sonra, ek deneyler, mutasyonlar ya da çeşitli kültür koşulları, vb yanıt olarak, zaman içinde Srna sinyal değişiklikleri izlemek için tasarlanmıştır. Şekil 1 genel bakteriyel Srna tespiti için bir LNA akış FISH deney düzeni tasviri. Şekil 2 Boyama ve LNA akış BALIK sinyal amplifikasyon. a) biotinlenmiş LNA prob hibridizasyon. b) floresan DyLight 488 streptavidin konjuge Boyama. c) biotinlenmiş anti-s CiltDyLight 488 streptavidin treptavidin antikor. Antikor, antijen-bağlayıcı sitesi aracılığıyla streptavidin bağlamak veya biotin artıkları ile streptavidin bağlı olabilir. d) floresan DyLight 488 streptavidin konjuge daha fazla boyama ile sinyal Amplifikasyon. Şekil 3: a) 1 mg / ml lizozim, 3 mg / ml proteinaz K permeabilization ve b) 5 mg / ml lizozim, 3 mg / ml proteinaz K permeabilization yan dağılım sonuçları karşısında ileri gösteren Flow sitometri nokta araziler . Şekil 4 LNA akış-FISH sonuçları Histogram analizi. Her örnekten üretilen floresan sinyal dört izleri gösterilmiştir: siyah – Srna özel LNA prob, kırmızı – 'olmayan ifade Srna' negatif kontrol, mavi – 'hiçbir LNA' negatif kontrol, mor -'Hayır boya' negatif kontrol.