ロックされた核酸のフローサイトメトリー、蛍光その場でハイブリダイゼーション（LNAフロー- FISH）：細菌のsmall RNAの検出のための方法

1。 LNAプローブと実験計画あなたの転写sRNA / mRNAの逆補数であるか、またはそれらにカスタムデザインをお持ちの設計LNAプローブwww.exiqon.com 。カスタム設計のオプションを使用している場合は、シーケンスを知っている、ではなく、LNAスパイクパターンになります。の間のT mの増加にDNAまたはRNAオリゴヌクレオチド結果に各LNA残基のほか2〜10 ° C LNA – RNAハイブリダイゼーションの二重14。理想的には、設計したLNAプローブは、長さ20〜25ヌクレオチド（長いプローブを合成するより困難である）の間であると85から90の間のT m℃のRNAのハイブリダイゼーションが必要です。 シーケンスを設計した後、BLASTの使用http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiをプローブにのみ興味のあるsRNA / mRNAに特異的であることを確認したり、ローカルデータベースへのプローブ配列を比較する。 LNAプローブをご注文の際は、LNAオリゴヌクレオチドの5'末端にビオチン- TEGの変更を追加。ビオチンは、ストレプトアビジン – 色素複合体とポストハイブリダイゼーション染色のために必要です。それは3にこの変更を追加することが可能である"必要があれば終わりが、5に加えて'末端には、安価で高収率になるはずです。 三ネガティブコントロール方法に含まれるべきである：（i）のLNAプローブはハイブリダイゼーション工程中に追加されていない'NO LNA"制御、LNAプローブはにハイブリダイズされている（II）"無色素"制御ターゲットsRNAがハイブリダイゼーションのイベントは順番に、存在しないまたは非発現sRNAをターゲットとLNAプローブを利用した制御を蛍光染色の欠如に起因する検出、および（iii）"非発現sRNA /発現"されていません非特異的ハイブリダイゼーションをモニターする。 ここに特定のLNAプローブはsRNA CsrBを補完するものであり、配列5' -ビオチン- TEG – gTccAttTccCgtCctTagCagC – 3'（LNAのモノマーでいます）の文字を大文字。 -20℃で10〜20μLのアリコートで50μg/ mLとし、店舗にヌクレアーゼフリー水で再懸濁し凍結乾燥LNAの受領、次のソリューション 8パーセントparaformaldehye（PFA）、PBS中10％酢酸：ミックス1 mLの32パーセントPFA、400μLの酢酸、400μL10 × PBS、pHは= 7.4、および2.2 mLのヌクレアーゼフリー水。冷凍アリコートの場合は、酢酸なし-20 ° Cで単回使用のアリコートに凍結する。 60パーセントデキストラン硫酸溶液：50mLのコニカルチューブに6.0グラムデキストラン硫酸を加え、10 mlの最終体積に水を加える。デキストラン硫酸（1-2時間を取ることができる）に溶解するまで℃の水浴中で65にこの混合物を加熱する。追加の水を10 mLのボリュームを維持するために可溶化プロセス全体を追加する必要があります。使用するまで-20℃でアリコート60パーセントデキストラン硫酸溶液および店。 2。固定生物発光の収穫1 × 10 8細胞<em>ビブリオcampbelliiたり、細菌関心のと1.5 mLのマイクロ遠心チューブに移す。細胞のこの量は、4つのフロー- FISHのサンプル（特定のLNAプローブのサンプル三ネガティブコントロール）のための十分な出発原料を提供します。他のsRNA / mRNAが種をテストする必要がある場合はさらに1.5 mlのマイクロ遠心チューブのアリコートを収集する必要があります。 ペレットを5分間2300 × gで遠心分離によって細菌細胞。ピペッティングにより上清を捨て、1 × PBS 400μLで細胞を再懸濁します。 この混合物に、、（1X PBS）溶液を緩衝生理食塩水うまくミックス1Xリン酸8％paraformaldehye（PFA）及び10％酢酸の400μLを追加し、25℃で10分間インキュベート℃、5分後に一度混合。すべてのインキュベーションは、特に断りのない限り、加熱管のホルダーで実行されます。 PFAのソリューションは、新しく調製し又は酢酸の添加後、凍結アリコートから使用する必要があります。パラホルムアルデヒドはhその架橋固定液です。elps細胞の形態を維持し、細胞内のRNAを保持する。 ペレットは、2分間に4500 × gで遠心分離によりこの混合物から細胞をピペッティングにより上清を取り除く。遠心分離を必要とする将来のすべての手順は同じ設定を（7K、2分）使用する必要があります。以下の遠心分離は、上清をピペッティングし、デカンテーションではないが除去されるべきであることに注意することは重要です。 400μL1X PBSで2回細胞を洗浄し、400μlの1X PBSで最終的に細胞ペレットを再懸濁します。細胞は修正され、4℃で保存できます400μlの1X PBSでCは、最大7日間。 3。ジエチルピロカーボネート処理 1X PBSでジエチルピロカーボネート（DEPC）（この溶液400μLをそれに応じてその規模テストされるすべてのサンプルのために必要とされる）の0.1％溶液400μLを準備します。 DEPC溶液はDEPCストックから、新鮮な準備する必要があります。 DEPC処理はcarbethoxylationでRNaseを不活性化し、減少バックグラウンド信号。 各固定細菌の細胞サンプル0.1％DEPC溶液400μLを追加し、ピペッティングによりよく混和する。 12分間2​​5℃でこの混合物をインキュベートする。 400μLの1 × PBS、細胞をペレット化（7K、2分）で細胞を2回洗浄し、上清を取り除く。 4。透過化は1.0 mg / mL溶液を1 mLのトリス- EDTA緩衝液（10mM Tris、1mMのEDTA、pH8.0）中にリゾチームの1.0ミリグラムを追加。このソリューションは、新鮮な準備する必要があります。 25℃で800セルに1 mg / mLのリゾチーム溶液のμL、ピペッティングでよく混合し、インキュベートを追加°時々混ぜながら30分間。ペレット細胞（7K、2分間）し、上清を取り除く。リゾチームは、細菌の細胞壁のペプチドグリカンに存在する加水分解することにより透過化の試薬として機能します。 TE緩衝液中のプロテイナーゼK 3.0μg/ mLの溶液を調製します。この溶液を-20℃で保存されている20 mg / mlのプロテ​​イナーゼKの在庫からの新鮮な準備する必要がありますプロテイナーゼKは、様々なタンパク質を消化し、RNAのプローブと試薬のアクセシビリティを支援するセリンプロテアーゼである。 細胞ペレットを〜3.0μg/ mLのプロテイナーゼK溶液800μLを追加し、ピペッティングでよく混ぜる。インキュベーションの途中にボルテックスしながら15分間25℃でインキュベートする。 ペレット細胞（7K、2分間）、上清を除去し、400μlの1X PBSで細胞を1回洗浄する。洗浄上清を除去した後、400μlの1 × PBSで細胞を再懸濁し、つの新しい1.5 mlのマイクロチューブに再懸濁液100μLを加える。ペレット細胞（7K、2分間）し、上清を取り除く。 5。交配各サンプルのハイブリダイゼーションバッファー（HB）100μLを準備します。 HBは、体積、質量10％デキストラン硫酸（100μL、60％デキストラン硫酸溶液の16.7μLを加える）、1Xデンハルト溶液、50mMリン酸ナトリウムpH7.0の50％ホルムアミドで構成されています2Xクエン酸ナトリウム（SSC）、剪断サケ精子DNA（SSSD）と20μgの酵母tRNAの20μgの。 HBの各コンポーネントは、異なる目的を持っています。ホルムアミドは、それによってRNAの変性と細胞の損傷を最小限に抑えることを手伝って核酸二重鎖の融解温度を下げる。デキストラン硫酸は、ポリマーは、プローブを集中し、ハイブリダイゼーションの速度を高めるために – を除くボリュームとして使用されます。 Denhardtsソリューションは、酵母tRNAとSSSDは、非特異的結合を減らすためにブロッキング剤として機能する。 セルの各々の再懸濁を含む1.5 mlのマイクロチューブを、95μLHBとsRNA /の5.0μL追加mRNAを特異的LNAまたは水（LNAネガティブコントロールがないため）[特定のLNAの最終濃度を20 pmolの]。次に例を示します。 チューブ1から95μLHB + 5.0μLsRNA / mRNAの特異的プローブチューブ2から95μLHB + 5.0μLsRNA / mRNAの特異的プローブ（"無色素"ネガティブコントロール） チューブ3から95μLHB + 5.0μLsRNA/ mRNAのプローブ（"非発現sRNA / mRNAは"ネガティブコントロール） 管4から95μLHB + 5.0μL水（'NO LNA"ネガティブコントロール） 60分間60℃ですべての4つのサンプルをインキュベートする。ハイブリダイゼーション温度は、LNAプローブ（S）T mに依存し、約30に設定する必要があります℃のアニーリングRNAのT mを予測以下。 HBの上昇、ハイブリダイゼーション温度とホルムアミドの両方がsRNAまたは関心のmRNAの二次構造の変性を保証します。 6。ポストハイブリダイゼーションの洗浄ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーション混合物に0.1％Tween – 20を1.0 mLの0.1 × SSC（SSCT）を追加します。これは、細胞が粘性のハイブリダイゼーション溶液から除去できるようにする必要があります。ペレット細胞（7K、2分間）し、上清を取り除く。 徹底的にとincub混ぜ、細胞のペレットに50％ホルムアミド200μLの、2X SSC、0.1％Tween – 20を追加65℃の加熱ブロックに30分間食べた。 混合、ペレット細胞（7K、2分）に1 mLの0.1 × SSCTを追加し、上清を取り除く。 細胞を再懸濁し、ヒートブロックで65℃40分℃でインキュベートする500μL0.1X SSCTを追加。ペレット細胞（7K、2分間）し、上清を取り除く。 7。ブロッキングと染色ブロッキングバッファー（BB）とストレプトアビジン – 色素染色液を準備する。 5X在庫から1X BBの溶液を調製します（市販の、試薬を参照）。 4本のチューブのすべてのセットの場合は、1.2 mLの1X BBを準備。 、細胞のペレットを200μL1X BBを追加し再懸濁し、25℃で30分間インキュベート℃、 ストレプトアビジンコンジュゲート色素、ビオチン化LNAプローブを検出するために使用されます。ブロックしながら、2μg/ mLのDyLight 488ストレプトアビジンまたは30分（三つの試料のために、300μLを加える）のための1X BBでご希望の色素-ストレプトアビジン複合体の溶液を調製。 incub後1X BB、細胞をペレット化（7K、2分間）、上清を除去するとation。 、細胞ペレットにストレプトアビジン – 色素溶液50μLを加えて完全に混合し、25℃で12分間インキュベート° C渦上またはサーモミキサーで一定のミキシングと。 "無色素"制御のために、わずか50μL1Xブロッキング緩衝液を加える。プロトコルの残りの部分では、アルミ箔を使用して、光からチューブを保護します。 500μL0.1X SSCTのバッファを持つと一度0.1％のTween – 20（PBST）400μL1 × PBSで細胞を1回洗浄する。ペレット細胞（7K、2分間）し、上清を取り除く。 最初のストレプトアビジンコンジュゲート染色後、信号はストレプトアビジン-色素複合体にビオチン化抗ストレプトアビジン抗体を導入してから（ 図2）ハイブリダイズしたLNAプローブあたりの信号の出力を増加させるため、ストレプトアビジン-色素で2回目を染色することによって増幅され。 1X PBS、resuspenで1μg/ mlのビオチン化抗ストレプトアビジン抗体を100μLを追加D細胞、および25℃でインキュベート時々混ぜながら30分間を。ペレット細胞（7K、2分間）、上清を除去し、400μlの1X PBSTで2回洗浄。 、細胞を2μg/ mLのストレプトアビジン – 色素溶液50μLを追加徹底的に混合し、25℃で12分間インキュベートします渦上またはサーモミキサーで混合定数Cを。 "無色素"制御のために、わずか50μL1Xブロッキング緩衝液を加える。 500μL0.1X SSCTのバッファーで1回細胞を洗浄し、一度400μL1X PBST。 4で200μL1X PBSTと店舗で細胞を再懸° C、フローサイトメトリー解析のための準備ができるまで。小さな細菌細胞のコアサイズを小さくするために減速する流量を設定します。さらに、前方散乱のしきい値のカットオフを持つフローサイトメーター用に、カットオフは小さな細菌細胞が検出されるように、可能な限り低く設定する必要があります。 DyLight 488検出のために、フローサイトメーターは、488 nmのレーザーと基準排出ガスに装備する必要がありますFITC用のフィルター。少なくとも2 × 10 4つのイベントを収集する必要があります。別のレーザーを搭載したフローサイトメーターとの互換性のために、他のストレプトアビジン結合蛍光色素は、このプロトコルのために使用することができます。 8。代表的な結果固定し、効果的に浸透化されたセルの例を図3aにフローサイトメトリードットプロットで示されています。透過化のために、上記の条件を使用する場合は、細胞集団は小さく、均一なことを示すいくつかの細胞集合体です。リゾチームの高い（5 mg / mLの）濃度が使用されている場合、細胞が凝集する可能性が高いとより大きな粒子（ 図3B）を示す前方に増加散布値を、示す。成功したLNAフロー- FISHの実験から、フローサイトメトリーデータの例を図4に示されています。ヒストグラムは、次の3つのネガティブコントロールと共にターゲットsRNAの特異的検出を示しています。"無色素"ネガティブコントロールは、"いいえLNA'と'非発現sRNA"ネガティブコントロールに続いて、少なくとも蛍光を生成します。最後に、sRNA固有のLNAプローブを用いたサンプルは、最大の蛍光を生成します。方法とLNAプローブはこの方法で検証されると、追加の実験が変異または様々な培養条件、等に反応して、時間をかけてsRNA信号の変化を監視するように設計することができます 図1。細菌sRNAの検出のためのLNAフロー- FISHの実験の全体的なスキームの描写。 図2。LNAフロー- FISH信号の染色と増幅。ビオチン化LNAプローブのa）ハイブリダイゼーション。蛍光DyLight 488ストレプトアビジンコンジュゲートとB）染色。ビオチン化抗- sのc）の結合DyLight 488ストレプトアビジンへtreptavidinの抗体。抗体はその抗原結合部位を介してストレプトアビジンを結合することができるか、そのビオチン残基を介してストレプトアビジンが結合することができる。蛍光DyLight 488ストレプトアビジンコンジュゲートとのさらなる染色による信号のd）の増幅。 図3。）1 mg / mLのリゾチーム、3μg/ mLのプロテイナーゼK透過およびb）5 mg / mLのリゾチーム、3μg/ mlのプロテイナーゼKの透過処理のための側方散乱の結果対前方に示すフローサイトメトリードットプロット。 図4。LNAフロー- FISHの結果のヒストグラム解析。各試料から発生する蛍光信号は、4つのトレースで示されています：ブラック – sRNA固有のLNAプローブ、赤 – "非発現sRNA"陰性コントロール;青 – 'NO LNA"ネガティブコントロール;紫 -"無色素"ネガティブコントロール。