Transfert de gènes à l'oreille de souris en développement intérieur par<em> In Vivo</em> Électroporation
Summary
L'oreille interne de souris est un organe placode dérivé sensorielle dont le développement du programme est élaboré pendant la gestation. Nous définissons un<em> In utero</em> Technique de transfert de gène constitué de trois étapes: la souris laparotomie ventrale, la microinjection transutérine, et<em> In vivo</em> Électroporation. Nous utilisons la microscopie vidéo numérique pour démontrer les critiques de techniques expérimentales embryologiques.
Abstract
L'oreille des mammifères intérieure dispose de 6 épithélium sensoriel distincte: 3 crêtes dans les ampoules des canaux semi-circulaires; macules de l'utricule et le saccule, et l'organe de Corti dans la cochlée enroulée. Le crêtes et macules contiennent des cellules ciliées vestibulaires que transduisent stimuli mécaniques servent les sens particulier de l'équilibre, tandis que les cellules ciliées auditives dans l'organe de Corti sont les principaux transducteurs pour entendre 1. Spécification du destin cellulaire dans ces épithéliums sensoriels et de la morphogenèse des canaux semi-circulaires et la cochlée se déroulera durant la deuxième semaine de gestation chez la souris et sont en grande partie achevé avant la naissance 2,3. Des études de développement de l'oreille de souris intérieure sont effectuées régulièrement par la récolte d'embryons transgéniques à différents stades embryonnaires ou postnatale afin de mieux comprendre la base moléculaire de cellulaire et / ou morphologique phénotypes 4,5. Nous émettons l'hypothèse que le transfert de gène à l'oreille de souris en développement in utero intérieure </ Em> dans le contexte de gain de-et la perte de fonction des études représente une approche complémentaire à la transgenèse souris traditionnelle pour l'interrogation sur les mécanismes génétiques qui sous-tendent le développement des mammifères oreille interne 6.
Le paradigme expérimental de mener des études dérégulation de gènes dans l'oreille interne de souris en développement ont démontré ici résout en trois étapes principales: 1) une laparotomie ventrale; 2) la microinjection transutérine et 3) électroporation de vivo. Laparotomie ventrale est une technique chirurgicale la survie des souris qui permet l'externalisation de l'utérus pour accéder expérimental aux embryons implantés 7. Microinjection transutérine est l'utilisation de verre, biseautées micropipettes capillaires à introduire le plasmide d'expression dans la lumière de la vésicule otique ou otocyst. In vivo électroporation est l'application d'onde carrée, impulsions de courant pour diriger l'expression plasmide dans des cellules progénitrices 8-10.
<p class = "jove_content"> Nous avons déjà décrit cette technique d'électroporation à base de transfert de gène et inclus des notes détaillées sur chaque étape du protocole 11. Souris techniques expérimentales embryologiques peut être difficile à apprendre de la prose et les images fixes uniquement. Dans le présent travail, nous démontrons les 3 étapes de la procédure de transfert de gène. La plupart des critiques, nous déployons la microscopie vidéo numérique pour montrer précisément comment: 1) déterminer l'orientation embryon de utero; 2) réorienter embryons à des fins de ciblage des injections à l'otocyst; 3) micro-injection d'ADN mélangé avec un traceur colorant dans la solution otocyst aux jours embryonnaires 11,5 et 12,5; 4) électroporer la otocyst injecté, et 5) embryons d'étiquettes électroporés pour la sélection postnatale à la naissance. Nous fournissons des exemples représentatifs de succès transfectées oreille interne, un guide illustré sur les causes les plus courantes de mauvais ciblage otocyst; discuter de la façon d'éviter les erreurs communes méthodologiques et des lignes directrices actuelles pour l'écriture d'un in utero gène protocole de transfert des soins aux animaux.Protocol
Discussion
Le transfert de gènes à l'oreille de souris en développement interne: L'oreille de la souris intérieure se développe à partir de la placode otique pendant la première semaine du développement post-implantation 12,13. Par jour embryonnaire 9.5 (E9.5), la placode a invaginé et transformé en une vésicule remplie de liquide appelé le otocyst 2. Précurseurs otiques dans la vésicule donner lieu à des cellules sensorielles et non sensorielles au sein de l'oreill…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier la presse pour Humana la permission de publier le chiffre de fabrication de micro-injection pipette qui a été publié à la page 130 de la référence 11; Larry Dlugas et Steven Wong, OHSU ministère des Communications pour l'éducation, pour la vidéographie; Larry Dlugas pour la conception et le montage vidéo; Adam M. O »Quinn, Senior Designer, Trion / Envirco pour la conception de notre coutume hotte à flux laminaire horizontal et Les Goldsmith pour fournir le schéma technique; Victor Monterroso, MV, MS, PhD et Tom Chatkupt, DVM, OHSU département de médecine comparée, pour obtenir des conseils avec notre protocole de soins des animaux, des techniques chirurgicales, et prophylactiques analgésie régime; Marcel Perret-Gentil, DVM, MS, pour le partage de son document sur les techniques de suture vétérinaires; Edward Porsov, MS, pour la conception de notre Adobe Premiere Pro vidéo microscopie poste de travail informatique, et Leah White et Jonas Hinckley du LNS sous-titrage (Portland, OR). Ce travail a été soutenu par des subventions de l'Institut national sur la surdité et d'Other troubles de la communication: DC et DC R01 008595 008595 R01-04S2 (à JB) et P30 DC005983 (Oregon audience Centre de recherche de base Grant, Peter Gillespie, chercheur principal).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Micro Sterilizing Case | ROBOZ | RS-9900a | 8X8.5X1.25 inches |
| Ball-tipped scissors | Fine Science Tools | 14109-09 | |
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11106-09 | 4.8mm ID/6mm OD |
| Adson Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Needle driver | Fine Science Tools | 12502-12 | |
| Allergy Syringe Tray | Becton Dickison | 305536 | |
| Suture 6-0 | Syneture | GL-889 | 0.7 metric gastrointestinal suture |
| Lactated Ringer’s Injection USP | Baxter | 2B2323 | |
| Fast green | Sigma Aldrich | F7258 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| Nembutal Sodium Solution | OVATION Pharmaceuticals Inc. | NDC 67386-501-52 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Propylene glycol | Fisher Scientific | P355-1 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500 | |
| Meloxicam | Boehringer Ingeheim | NADA 141-219 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | FB255B box filament; consult Pipette Cookbook from Sutter instruments |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | 104C beveling disk for large pipettes; consult owner’s manual for beveling theory |
| Micropipette holder | Warner Instruments | MP-S15T | For 1.5mm outer diameter pipette and female pressure port for Picospritzer tubing. |
| Tweezers-style electrode | Protech International Inc. | CUY650P5 | 5 mm outer diameter |
| Square Wave Electroporator | Protech International Inc. | CUY21EDIT | Footpedal recommended |
| PICOSPRITZER III | Parker Hannifin | 051-0500-900 | Footpedal recommended |
| Manual Control Micromanipulator | Harvard Apparatus | 640056 | |
| Horizontal laminar flow clean bench | Envirco | Custom modifications to LF 630-10554. See supplementary information for hood schematic. | |
| Leica stereofluorescence dissecting microcope with Lumencor SOLA light engine | Bartels and Stout and Lumencor | MZ10F with Lumencor SOLA light engine | Footpedals to focus the MZ10F and to trigger the SOLA light engine are recommended |
| Alexa Fluor 594 Dextran | Invitrogen | D22913 | 10mg/ml, aqueous |
| Alexa Fluor 488 Dextran | Invitrogen | D22910 | 10mg/ml, aqueous |
| Enviro-dri | Shepherd Specialty Papers | www.ssponline.com |
Referências
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