ין העברת לאוזן הפנימית על ידי פיתוח מאוס<em> In vivo</em> Electroporation
Summary
האוזן הפנימית העכבר הוא איבר placode הנגזרות חושית אשר התפתחותית תוכנית מפורטת במהלך ההריון. אנו מגדירים<em> ברחם</em> העברת גנים הטכניקה המורכבת משלושה שלבים: laparotomy העכבר הגחון, microinjection transuterine, ו<em> In vivo</em> Electroporation. אנו משתמשים במיקרוסקופ וידאו דיגיטלי להדגים טכניקות קריטיים העוברית ניסיוניים.
Abstract
האוזן הפנימית יונקים יש 6 epithelia חושית ייחודית: 3 cristae ב ampullae של תעלות בצורת חצי עיגול, maculae ב utricle ו שקיק, ואת האיבר של קורטי ב שבלול מפותל. Cristae ו maculae מכילים תאים שיער וסטיבולריות כי transduce גירויים מכניים כדי subserve תחושה מיוחדת של איזון, בעוד שיער השמיעה התאים איבר של קורטי הם מתמרים העיקריות לשמוע 1. גורל התא הפירוט epithelia אלה המורפוגנזה חושית של התעלות ושל בצורת חצי עיגול שבלול להתקיים בשבוע השני של ההריון של העכבר הושלמו בעיקר לפני הלידה 2,3. מחקרים התפתחותיים של האוזן הפנימית העכבר נעשות באופן שגרתי על ידי איסוף עוברים מהונדס בשלבים עובריים או לאחר לידה שונים כדי לקבל תובנה על הבסיס המולקולרי של הסלולרי ו / או פנוטיפים מורפולוגי 4,5. אנו משערים כי העברת גנים לאוזן העכבר בפיתוח הפנימי ברחם < / Em> בהקשר של רווח והפסד של תפקודי מחקרים מייצג גישה חינם ל transgenesis העכבר המסורתי לחקירה של המנגנונים הגנטיים העומדים בבסיס האוזן יונקים הפיתוח הפנימי 6.
פרדיגמה ניסויית לנהל misexpression מחקרים גנים באוזן העכבר פיתוח פנימי הוכיח כאן פותר לשלושה שלבים כלליים: 1) laparotomy הגחון; 2) microinjection transuterine, ו 3) ב electroporation vivo. Laparotomy הגחון הוא ההישרדות העכבר טכניקה כירורגית המאפשר החצנה של הרחם כדי לקבל גישה ניסויית על העוברים המושתלים 7. Microinjection Transuterine הוא השימוש, micropipettes משופעים זכוכית נימי להציג את הביטוי הפלסמיד לתוך לומן של שלפוחית otocyst otic או. בחי electroporation הוא יישום של גל מרובע, קטניות השוטפות הניתנות באופן ישיר לנהוג ביטוי הפלסמיד לתוך 8-10 ובתאים.
<p clהתחת = "jove_content"> אנחנו קודם לכן תיאר את electroporation מבוססת טכניקת העברת גנים כלל הערות מפורטות על כל צעד של פרוטוקול 11. טכניקות עכבר העוברית הניסוי יכול להיות קשה ללמוד פרוזה תמונות סטילס בלבד. במחקר הנוכחי, אנחנו מדגימים את 3 השלבים בהליך העברת גנים. הכי קריטי, אנחנו לפרוס מיקרוסקופיה וידאו דיגיטלי להראות בדיוק איך: 1) לזהות את האוריינטציה העובר ברחם; 2) לארגון מחדש של עוברים למיקוד זריקות כדי otocyst; 3) microinject DNA מעורבב עם פתרון צבע נותב אל otocyst על ימים עובריים 11.5 12.5: 4) electroporate otocyst מוזרק, ו 5) עוברים תווית electroporated לבחירה לאחר הלידה בלידה. אנו מספקים דוגמאות מייצגות של האוזניים הפנימיות transfected בהצלחה: מדריך מצולם על הסיבות השכיחות ביותר של Mistargeting otocyst, לדון כיצד ניתן למנוע טעויות מתודולוגיות משותפות וכן הנחיות לכתיבת הנוכחיים ברחם גרםטיפול בבעלי חיים מז העברת הפרוטוקול.Protocol
Discussion
העברת גנים לאוזן העכבר בפיתוח פנימי: האוזן הפנימית העכבר מתפתחת placode otic בשבוע הראשון של פיתוח postimplantation 12,13. ביום העוברית 9.5 (E9.5), placode יש invaginated ו morphed לתוך שלפוחית מלא נוזלים הנקרא otocyst 2. מבשרי Otic ב שלפוחית להצמיח תאים תחושתיים nonsensory בתוך האוז?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחץ הומנה רשות לפרסם פיפטה microinjection ייצור דמות אשר הופיע במקור בעמוד 130 התייחסות 11, לארי Dlugas וסטיבן וונג, OHSU החוג לתקשורת חינוך, על videography, לארי Dlugas לעיצוב וידיאו ועריכה: אדם מ O "קווין, מעצב בכיר, Trion / Envirco לעיצוב מותאם אישית זרימת אופקי שלנו למינרית מכסה המנוע Les גולדסמית למתן סכמטי טכני; ויקטור Monterroso, MV, MS, PhD וטום Chatkupt, DVM, OHSU המחלקה לרפואה השוואתי, עם הדרכה שלנו בעלי חיים פרוטוקול טיפול, טכניקות כירורגיות, ו מניעתי כאבים משטר, מרסל Perret-ג'נטיל, DVM, MS, לשיתוף דף מידע על טכניקות תפירת וטרינריים, אדוארד מפורסוב, MS, לעיצוב Adobe Premiere שלנו במיקרוסקופ Pro תחנת עבודה וידאו במחשב, ולאה הלבן ג'ונאס הינקלי של LNS captioning (פורטלנד, או). עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לחירשות otheR-להפרעות בתקשורת: DC ו DC R01 008595 008595 R01-04S2 (כדי JB) ו – p30 DC005983 (אורגון שמיעה מרכז המחקר Core גרנט, פיטר גילספי, החוקר הראשי).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Micro Sterilizing Case | ROBOZ | RS-9900a | 8X8.5X1.25 inches |
| Ball-tipped scissors | Fine Science Tools | 14109-09 | |
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11106-09 | 4.8mm ID/6mm OD |
| Adson Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Needle driver | Fine Science Tools | 12502-12 | |
| Allergy Syringe Tray | Becton Dickison | 305536 | |
| Suture 6-0 | Syneture | GL-889 | 0.7 metric gastrointestinal suture |
| Lactated Ringer’s Injection USP | Baxter | 2B2323 | |
| Fast green | Sigma Aldrich | F7258 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| Nembutal Sodium Solution | OVATION Pharmaceuticals Inc. | NDC 67386-501-52 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Propylene glycol | Fisher Scientific | P355-1 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500 | |
| Meloxicam | Boehringer Ingeheim | NADA 141-219 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | FB255B box filament; consult Pipette Cookbook from Sutter instruments |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | 104C beveling disk for large pipettes; consult owner’s manual for beveling theory |
| Micropipette holder | Warner Instruments | MP-S15T | For 1.5mm outer diameter pipette and female pressure port for Picospritzer tubing. |
| Tweezers-style electrode | Protech International Inc. | CUY650P5 | 5 mm outer diameter |
| Square Wave Electroporator | Protech International Inc. | CUY21EDIT | Footpedal recommended |
| PICOSPRITZER III | Parker Hannifin | 051-0500-900 | Footpedal recommended |
| Manual Control Micromanipulator | Harvard Apparatus | 640056 | |
| Horizontal laminar flow clean bench | Envirco | Custom modifications to LF 630-10554. See supplementary information for hood schematic. | |
| Leica stereofluorescence dissecting microcope with Lumencor SOLA light engine | Bartels and Stout and Lumencor | MZ10F with Lumencor SOLA light engine | Footpedals to focus the MZ10F and to trigger the SOLA light engine are recommended |
| Alexa Fluor 594 Dextran | Invitrogen | D22913 | 10mg/ml, aqueous |
| Alexa Fluor 488 Dextran | Invitrogen | D22910 | 10mg/ml, aqueous |
| Enviro-dri | Shepherd Specialty Papers | www.ssponline.com |
Referências
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).
- Kelley, M. W. Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear. Nat. Rev. Neurosci. 7, 837-849 (2006).
- Ohyama, T. BMP signaling is necessary for patterning the sensory and nonsensory regions of the developing mammalian cochlea. J. Neurosci. 30, 15044-15051 (2010).
- Pan, W., Jin, Y., Stanger, B., Kiernan, A. E. Notch signaling is required for the generation of hair cells and supporting cells in the mammalian inner ear. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15798-15803 (2010).
- Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Mitchell, J. C., Ricci, A. J., Brigande, J. V. Functional auditory hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer. Nature. 455, 537-541 (2008).
- . . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , (2010).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44, 5-14 (2006).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Brigande, J. V., Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Jungwirth, J. J., Bresee, C. S. Electroporation-mediated gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol. Biol. 493, 125-139 (2009).
- Morsli, H., Choo, D., Ryan, A., Johnson, R., Wu, D. K. Development of the mouse inner ear and origin of its sensory organs. J. Neurosci. 18, 3327-3335 (1998).
- Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta. Otolaryngol. , 1-77 (1971).
- Sheffield, A. M. Viral vector tropism for supporting cells in the developing murine cochlea. Hear Res. 277, 28-36 (2011).
- Bedrosian, J. C. In vivo delivery of recombinant viruses to the fetal murine cochlea: transduction characteristics and long-term effects on auditory function. Mol. Ther. 14, 328-335 (2006).
- Reisinger, E. Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis. J. Neurosci. 31, 4886-4895 (2011).
- Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Mol. Biol. 7, 46 (2006).
- Perret-Gentil, M. . Principles of Veterinary Suturing. , .
- Oesterle, A. . P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. , (2011).
