نقل الجينات إلى الأذن الداخلية عن طريق تطوير ماوس<em> في الجسم الحي</em> Electroporation
Summary
الأذن الداخلية الماوس هي جهاز اللوحاء المستمدة من الحواس التي التنموية البرنامج وضعت خلال فترة الحمل. نحن تعريف<em> في الرحم</em> تقنية نقل الجينات التي تتكون من ثلاث خطوات: الفأر البطن بطني، microinjection transuterine، و<em> في الجسم الحي</em> electroporation. نحن نستخدم الفيديو الرقمية المجهر لإثبات حاسم تقنيات الجنينية التجريبية.
Abstract
الأذن الداخلية الثدييات على 6 ظهائر الحسية متميزة: 3 عرف في الأمبولات من القنوات نصف دائري؛ بقع في utricle والكييس، وعضو كورتي في القوقعة ملفوف. وعرف وبقع تحتوي على خلايا شعر الدهليزي أن transduce المحفزات الميكانيكية إلى أيد بالمعنى الخاص للتوازن، في حين أن خلايا الشعر السمعي في جهاز كورتي هي محولات الطاقة الأولية لعقد جلسات استماع 1. خلية مواصفات مصير هؤلاء في ظهائر الحسي والتشكل من القنوات الهلالية والقوقعة تجرى خلال الأسبوع الثاني من الحمل في الماوس ويتم الانتهاء إلى حد كبير قبل الولادة 2،3. وتجرى بشكل روتيني دراسات التنموية في الأذن الداخلية من خلال الماوس حصاد الأجنة وراثيا في مختلف المراحل الجنينية أو بعد الولادة إلى التبصر في الأساس الجزيئي لل/ والخلوية أو الظواهر المورفولوجية 4،5. نحن نفترض أن نقل الجينات إلى الأذن الداخلية الماوس النامية في الرحم < / em> في سياق المكاسب والخسائر من دراسات وظيفة يمثل نهجا مجانية إلى transgenesis الماوس التقليدية للاستجواب من الآليات الوراثية الكامنة وراء تطور الثدييات الأذن الداخلية 6.
نموذج تجريبي لإجراء دراسات misexpression الجينات في الأذن الداخلية الماوس النامية أثبتت هنا يحل في ثلاث خطوات عامة: 1) البطن بطني، 2) microinjection transuterine، و 3) في electroporation الجسم الحي. البطن بطني هو أسلوب البقاء على قيد الحياة الماوس الجراحية التي تسمح لجهات خارجية من الرحم للوصول تجريبية لزرع الأجنة 7. microinjection Transuterine هو استخدام مشطوف بال micropipettes الزجاج، وشعري لإدخال التعبير البلازميد في تجويف الحويصلة الأذنية أو otocyst. في الجسم الحي electroporation هو تطبيق موجة مربع، والبقول الحالية مباشرة إلى قيادة التعبير البلازميد إلى 8-10 الخلايا الاصلية.
<p clالحمار = "jove_content"> نحن سبق وصفها هذا نقل الجينات electroporation القائم على تقنية وشملت مذكرات مفصلة عن كل خطوة من البروتوكول 11. يمكن للتقنيات الفأر الجنينية التجريبية يكون من الصعب معرفة من النثر والصور الثابتة وحدها. في العمل الحالي، ونحن شرح الخطوات 3 في الجينات إجراء التحويل. الأهم من ذلك، نحن نشر الرقمي المجهر الفيديو لاظهار وجه التحديد كيفية: 1) تحديد اتجاه الجنين في الرحم، 2) إعادة توجيه الأجنة لاستهداف الحقن لotocyst، 3) microinject الحمض النووي مختلطة مع حل الصبغة الكاشفة في otocyst في أيام الجنينية 11.5 و 12.5، 4) electroporate في otocyst حقنه، و 5) الأجنة التسمية electroporated لاختيار ما بعد الولادة عند الولادة. ونحن نقدم نماذج تمثيلية من الأذن الداخلية transfected بنجاح، ودليل التصويرية لأكثر الأسباب شيوعا للmistargeting otocyst؛ مناقشة كيفية تجنب الأخطاء المنهجية المشتركة، والمبادئ التوجيهية الحالية للكتابة في الرحم زين رعاية الحيوان بروتوكول نقل.Protocol
Discussion
نقل الجينات إلى الأذن الداخلية الماوس النامية: الأذن الداخلية الماوس يطور من اللوحاء أذني خلال الأسبوع الأول من التنمية postimplantation 12،13. بعد يوم الجنينية 9.5 (E9.5)، فقد invaginated في اللوحاء وتحولت إلى حويصلة مملوءة بسائل يسمى otocyst 2. السلائف أذني في حويصلة…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر هيومانا الصحافة للحصول على إذن لنشر تلفيق ماصة microinjection الرقم الذي ظهر أصلا في الصفحة 130 من مرجع 11؛ لاري Dlugas ستيفن وونغ، OHSU وزارة الاتصالات للتربية وللبالفيديو، لاري Dlugas لتصميم الفيديو والتحرير؛ آدم M. O 'كوين، مصمم مميز، Trion / Envirco لتصميم عادتنا تدفق رقائقي الأفقي غطاء محرك السيارة وغولدسميث ليه لتوفير التخطيطي التقنية؛ فيكتور مونتيروسو، MV، ماجستير، دكتوراه، وChatkupt توم، DVM، OHSU قسم الطب المقارن، للاسترشاد مع شركائنا حيوان بروتوكول الرعاية، والتقنيات الجراحية، ونظام وقائي للوعي، مارسيل بيريت، جنتيل، DVM، MS، لتبادل النشرات له على تقنيات خياطة البيطرية؛ إدوارد Porsov، MS، لتصميم لدينا برنامج Adobe Premiere Pro والفيديو المجهر محطة عمل الكمبيوتر، والأبيض وليا جوناس هينكلي من LNS السفلية (بورتلاند، أو). وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد القومي للصمم وآلات موسيقية أخرىص اضطرابات التواصل: DC R01 008595 و 008595-R01 العاصمة 04S2 (لJB) وP30 DC005983 (ولاية أوريغون السمع مركز البحوث الأساسية غرانت، بيتر جيليسبي، الباحث الرئيسي).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Micro Sterilizing Case | ROBOZ | RS-9900a | 8X8.5X1.25 inches |
| Ball-tipped scissors | Fine Science Tools | 14109-09 | |
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11106-09 | 4.8mm ID/6mm OD |
| Adson Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Needle driver | Fine Science Tools | 12502-12 | |
| Allergy Syringe Tray | Becton Dickison | 305536 | |
| Suture 6-0 | Syneture | GL-889 | 0.7 metric gastrointestinal suture |
| Lactated Ringer’s Injection USP | Baxter | 2B2323 | |
| Fast green | Sigma Aldrich | F7258 | |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| Nembutal Sodium Solution | OVATION Pharmaceuticals Inc. | NDC 67386-501-52 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Propylene glycol | Fisher Scientific | P355-1 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500 | |
| Meloxicam | Boehringer Ingeheim | NADA 141-219 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | FB255B box filament; consult Pipette Cookbook from Sutter instruments |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | 104C beveling disk for large pipettes; consult owner’s manual for beveling theory |
| Micropipette holder | Warner Instruments | MP-S15T | For 1.5mm outer diameter pipette and female pressure port for Picospritzer tubing. |
| Tweezers-style electrode | Protech International Inc. | CUY650P5 | 5 mm outer diameter |
| Square Wave Electroporator | Protech International Inc. | CUY21EDIT | Footpedal recommended |
| PICOSPRITZER III | Parker Hannifin | 051-0500-900 | Footpedal recommended |
| Manual Control Micromanipulator | Harvard Apparatus | 640056 | |
| Horizontal laminar flow clean bench | Envirco | Custom modifications to LF 630-10554. See supplementary information for hood schematic. | |
| Leica stereofluorescence dissecting microcope with Lumencor SOLA light engine | Bartels and Stout and Lumencor | MZ10F with Lumencor SOLA light engine | Footpedals to focus the MZ10F and to trigger the SOLA light engine are recommended |
| Alexa Fluor 594 Dextran | Invitrogen | D22913 | 10mg/ml, aqueous |
| Alexa Fluor 488 Dextran | Invitrogen | D22910 | 10mg/ml, aqueous |
| Enviro-dri | Shepherd Specialty Papers | www.ssponline.com |
Referências
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).
- Kelley, M. W. Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear. Nat. Rev. Neurosci. 7, 837-849 (2006).
- Ohyama, T. BMP signaling is necessary for patterning the sensory and nonsensory regions of the developing mammalian cochlea. J. Neurosci. 30, 15044-15051 (2010).
- Pan, W., Jin, Y., Stanger, B., Kiernan, A. E. Notch signaling is required for the generation of hair cells and supporting cells in the mammalian inner ear. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15798-15803 (2010).
- Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Mitchell, J. C., Ricci, A. J., Brigande, J. V. Functional auditory hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer. Nature. 455, 537-541 (2008).
- . . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , (2010).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44, 5-14 (2006).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Brigande, J. V., Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Jungwirth, J. J., Bresee, C. S. Electroporation-mediated gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol. Biol. 493, 125-139 (2009).
- Morsli, H., Choo, D., Ryan, A., Johnson, R., Wu, D. K. Development of the mouse inner ear and origin of its sensory organs. J. Neurosci. 18, 3327-3335 (1998).
- Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta. Otolaryngol. , 1-77 (1971).
- Sheffield, A. M. Viral vector tropism for supporting cells in the developing murine cochlea. Hear Res. 277, 28-36 (2011).
- Bedrosian, J. C. In vivo delivery of recombinant viruses to the fetal murine cochlea: transduction characteristics and long-term effects on auditory function. Mol. Ther. 14, 328-335 (2006).
- Reisinger, E. Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis. J. Neurosci. 31, 4886-4895 (2011).
- Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Mol. Biol. 7, 46 (2006).
- Perret-Gentil, M. . Principles of Veterinary Suturing. , .
- Oesterle, A. . P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. , (2011).
