Summary

無菌マウスでのプログレッシブ植民地時代に肝代謝変化を評価する 1 H NMR分光法

Published: December 15, 2011
doi:

Summary

プログレッシブ植民地化の手順は、さらにホストの肝代謝への影響を評価するために記述されています。肝代謝が高分解能マジック角スピニング(人事MAS)無傷の生検のNMRプロファイリングによって評価されている間植民地化は、NMRベースの代謝プロファイリングによる共同代謝微生物の尿中排泄を評価することにより、侵襲的、非監視されます。

Abstract

それは、腸内細菌がこのような免疫保護とビタミンの合成など、さまざまな利点を提供し、ホストの恒常性に大きく貢献することはよく知られています。彼らはまた、このエコシステムに不可欠な代謝の臓器作り、栄養素のかなりの量のホストを指定します。ホストとその腸内細菌叢との間の代謝相互作用を理解する腸内細菌叢とメタボリックシンドロームとの間のリンク、の増加する証拠の文脈では、現代生物学の重要な課題となってきています。1-4

植民地化は(また、正規化のプロセスとも呼ばれる)の元無菌動物における微生物の設立を指定します。それは、出生時に発生する自然なプロセスですが、それはまた腸花生態系を制御し、さらにホストの代謝への影響を判断するために成人無菌動物で使用されています。植民地化のプロセスを制御するための一般的な手順は、singlで強制経口投与の方法を使用することです。eまたは微生物の混合物。このメソッドは、非常に迅速に植民地化の結果、5非常にストレスであることの不利を提示。したがって、ストレスを最小限に抑え、徐々にホストの代謝上の細菌の設立の影響を観察するために低速の植民地化のプロセスを取得すると便利です。

この原稿では、我々は非破壊メタボリックプロファイリング技術を使用して徐々に植民地化の過程で肝代謝の変更を評価する手順を説明します。我々は、1 H NMRベースの代謝プロファイリングによる共同代謝微生物の尿中排泄により反射された腸内微生物の代謝活性を評価することによって、腸内微生物のコロニー形成を監視するために提案する。これは通常、DGGE(勾配ゲル電気泳動を変性)による糞便細菌を監視することにより評価した腸内微生物生態系の安定した設置を超える腸内微生物活性の安定性の理解が可能になります。6植民地化は、従来のオープンな環境で行われ、汚れたゴミ対照となる従来の動物、で汚れたによって開始されます。糞食性の動物がいるげっ歯類は、これは前述のように均質な植民地化を保証します

肝代謝プロファイリングは、NMR分光法をスピニング1 H高分解能マジック角を使用して無傷の肝生検から直接測定されます。この半定量的な手法は、さらに植民地化のプロセスと肝代謝70から10の間の複雑な相互作用を推定するために、セル構造に損傷を与えることなく、そのようなトリグリセリド、グルコースとグリコーゲンなどの主要な代謝物を評価するための素早い方法を提供しています。このメソッドは任意の組織生検11,12に適用することもできます。

Protocol

1。無菌動物とサンプル採取の植民地化無菌アイソレーターと家それらのコントロール(図1)となる従来の動物の前にフィルターを装備したケージの中で、従来の飼育室内から動物を取り外します。 無菌動物のくずで制御従来のケージから取り出したゴミ(3日齢)の半分を混ぜる。常に汚れた従来のゴミの1 / 3は、細菌のレベルを(少なくとも3日間それを保つ)を維持するた?…

Discussion

このプロトコルでは、我々はさらに無傷の生検の1 H人事MAS NMRのプロファイリングにより評価された肝代謝で腸内細菌の影響を調査するためにオープンな環境で進歩的な植民地化の手順を説明した。植民地化の様々な方法が文献に記載されている。定義された細菌を持つ動物を植民地化する最も一般的な方法は強制経口投与または汚染された飲料水19,20です。糞便の接種は、前…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

例示的な例として使用されるすべてのNMRスペクトルは、財政的にネスレでサポートされていた以前に発行された研究7から派生しています。

Materials

Table of specific reagents and equipment:

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
2.5 mm microtube New Era NE-H5/2.5-V-Br
1.7 mm capillary tube Sigma-Aldrich NORS175001
Capillary adapter New Era NE-325-5/1.7
Extraction rod New Era NE-341-5
HR-MAS rotor BL4 with 50 μL
spherical Teflon spacer kit
Bruker HZ07213
Tool kit for 50 μL inserts Bruker B2950
Advance III 600 MHz NMR Bruker
1H HR MAS NMR solid probe Bruker
Deuterium oxide 99.9 % Sigma-Aldrich 530867-1L
3-(trimethylsilyl)propionic
acid-d4 (TSP)
Sigma-Aldrich 269913

Referências

  1. Cani, P. D., Delzenne, N. M. Gut microflora as a target for energy and metabolic. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. 10, 729-734 (2007).
  2. Ley, R. E., Turnbaugh, P. J., Klein, S., Gordon, J. I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature. 444, 1022-1023 (2006).
  3. Raoult, D. Obesity pandemics and the modification of digestive bacterial flora. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 27, 631-634 (2008).
  4. Turnbaugh, P. J., Backhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. Diet-induced obesity is linked to marked but reversible alterations in the mouse distal gut microbiome. Cell. Host. Microbe. 3, 213-223 (2008).
  5. Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 43, 42-51 (2004).
  6. Muyzer, G., Smalla, K. Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology. Antonie van Leeuwenhoek. 73, 127-141 (1998).
  7. Claus, S. P. Colonization-induced host-gut microbial metabolic interaction. MBio. 2, (2011).
  8. Waters, N. J. High-resolution magic angle spinning 1H NMR spectroscopy of intact liver and kidney: optimization of sample preparation procedures and biochemical stability of tissue during spectral acquisition. Anal. Biochem. 282, 16-23 (2000).
  9. Bollard, M. E. High-resolution 1H and 1H-13C magic angle spinning NMR spectroscopy of rat liver. Magnetic resonance in medicine. 44, 201-207 (2000).
  10. Lindon, J. C., Holmes, E., Nicholson, J. Pattern recognition methods and applications in biomedical magnetic resonance. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 39, 1-40 (2001).
  11. Tate, A. R. Distinction between normal and renal cell carcinoma kidney cortical biopsy samples using pattern recognition of (1)H magic angle spinning (MAS) NMR spectra. NMR. Biomed. 13, 64-71 (2000).
  12. Wang, Y. Topographical variation in metabolic signatures of human gastrointestinal biopsies revealed by high-resolution magic-angle spinning 1H NMR spectroscopy. Journal of Proteome Research. 6, 3944-3951 (2007).
  13. Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation times. The review of scientific instruments. 29, 688-691 (1958).
  14. Nicholson, J. K., Holmes, E., Wilson, I. D. Gut microorganisms, mammalian metabolism and personalized health care. Nat. Rev. Microbiol. 3, 431-438 (2005).
  15. Martin, F. P. Effects of probiotic Lactobacillus paracasei treatment on the host gut tissue metabolic profiles probed via magic-angle-spinning NMR spectroscopy. Journal of Proteome Research. 6, 1471-1481 (2007).
  16. Swann, J. R. Variation in Antibiotic-Induced Microbial Recolonization Impacts on the Host Metabolic Phenotypes of Rats. J. Proteome. Res. , (2011).
  17. Jacobs, D. M., Gaudier, E., van Duynhoven, J., Vaughan, E. E. Non-digestible food ingredients, colonic microbiota and the impact on gut health and immunity: a role for metabolomics. Curr. Drug. Metab. 10, 41-54 (2009).
  18. Beckonert, O. High-resolution magic-angle-spinning NMR spectroscopy for metabolic profiling of intact tissues. Nat. Protoc. 5, 1019-1032 (2010).
  19. Hooper, L. V., Sansonetti, P., Zychlinsky, A. . Methods in microbiology. 31, 559-589 (2002).
  20. Rahija, R. J., Fox, J. G. Ch. 7. The mouse in biomedical research. , 217-234 (2007).
  21. Goodwin, B. L., Ruthven, C. R., Sandler, M. Gut flora and the origin of some urinary aromatic phenolic compounds. Biochemical Pharmacology. 47, 2294-2297 (1994).
  22. Koopman, J. P. ‘Normalization’ of germfree mice after direct and indirect contact with mice having a ‘normal’ intestinal microflora. Lab Anim. 20, 286-290 (1986).
  23. Nishikata, N., Shikata, N., Kimura, Y., Noguchi, Y. Dietary lipid-dependent regulation of de novo lipogenesis and lipid partitioning by ketogenic essential amino acids in mice. Nutrition and Diabetes. 1, 1-12 (2011).
  24. Spagou, K. A GC-MS metabolic profiling study of plasma samples from mice on low- and high-fat diets. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life. Sci. 879, 1467-1475 (2011).
  25. Sanchez-Patan, F., Monagas, M., Moreno-Arribas, M. V., Bartolome, B. Determination of microbial phenolic acids in human faeces by UPLC-ESI-TQ MS. J. Agric. Food. Chem. 59, 2241-2247 (2011).
  26. Roux, A., Lison, D., Junot, C., Heilier, J. F. Applications of liquid chromatography coupled to mass spectrometry-based metabolomics in clinical chemistry and toxicology: A review. Clin. Biochem. 44, 119-135 (2011).
  27. Ryan, D., Robards, K., Prenzler, P. D., Kendall, M. Recent and potential developments in the analysis of urine: a review. Anal. Chim. Acta. 684, 8-20 (2011).
  28. Nagayama, K., Wuthrich, K., Bachmann, P., Ernst, R. R. Two-dimensional J-resolved 1H n.m.r. spectroscopy for studies of biological macromolecules. Biochem. Biophys. Res. Commun. 78, 99-105 (1977).
  29. Aue, W. P., Bartholdi, E., Ernst, R. R. Two-dimensional spectroscopy. Application to nuclear magnetic resonance. J. Chem. Phys. 64, 2229-2246 (1975).
  30. Bodenhausen, G., Ruben, D. J. Natural abundance 15N NMR by enhanced heteronuclear spectroscopy. Chemical. Physics. Letters. 69, 185-189 (1980).
  31. Fan, T. W. -. M. Metabolite profiling by one- and two-dimensional NMR analysis of complex mixtures. Progress in nuclear magnetic resonance spectroscopy. 28, 161-219 (1996).
  32. Fan, T., Lane, A. Structure-based profiling of metabolites and isotopomers by NMR. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 52, 48-48 (2008).
  33. Fonville, J. M. The evolution of partial least squares models and related chemometric approaches in metabonomics and metabolic phenotyping. Journal of Chemometrics. 24, 636-649 (2010).
  34. Merrifield, C. A. A metabolic system-wide characterisation of the pig: a model for human physiology. Mol. Biosyst. , (2011).
  35. Tugnoli, V. Molecular characterization of human gastric mucosa by HR-MAS magnetic resonance spectroscopy. International Journal of Molecular Medicine. 14, 1065-1071 (2004).
  36. Sitter, B. Comparison of HR MAS MR spectroscopic profiles of breast cancer tissue with clinical parameters. NMR Biomed. 19, 30-40 (2006).
  37. Beckonert, O. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nat. Protoc. 2, 2692-2703 (2007).

Play Video

Citar este artigo
Heath, P., Claus, S. P. Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy. J. Vis. Exp. (58), e3642, doi:10.3791/3642 (2011).

View Video