Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

1. MDCK culture de cellules Culture 5 millions de cellules MDCK nuit dans un T-75 cm 2 flacon dans 20 ml de milieu RPMI1640 complet avec 10% de FBS, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 1 mM pyruvate de sodium, 5% de bicarbonate de sodium 7,5% solution et 0,001% β-mercaptoéthanol dans un incubateur à 37 ° C infusé avec 5,2% de CO 2. 2. PR8 infection et de collecte de fluide BAL Défi souris C57BL / 6 par voie intranasale avec 5000 UFP de virus PR8 dans du PBS stérile dans un volume total de 30 pi par une narine. Effectuer des simulations en utilisant uniquement les infections du PBS stérile sans le virus. Euthanasier souris 0, 2, 4 et 7 jours après l'infection et de réduire la cavité thoracique ouvrir et faire un parallèle 1 cm incision de la trachée à travers la fourrure de la souris pour l'exposer. Faire une incision médiane sur la partie proximale de la trachée. Faire infuser la trachée avec 0,5 ml de BSA PBS-1% et aspirer la BAL de liquide. Liquides de LBA peut être stocké dans -20 ° C congélateur jusqu'à ce que utilisé. 3. Infection par le virus et la détection de protéine de la matrice virale (M2) avec l'Odyssée LI-COR Pour quantifier les titres viraux à l'aide infra rouge colorant conjugués anticorps, récolter les cellules MDCK de T-75 cm 2 flacons et les plaques en optique à fond plat noir 96 puits (10.000 cellules par puits) ou de 384 puits (5000 cellules par puits ) plaques. Culture des cellules MDCK pour une nuit à 37 ° C en milieu RPMI1640 complet et laver deux fois avec du sérum sans DMEM contenant BSA (0,2%, en poids / volume), la pénicilline (100 U / ml), streptomycine (100 ug / ml), de sodium pyruvate (1 mM), une solution de bicarbonate de sodium (5% de 7,5%) et β-mercaptoéthanol (0,001%). Incuber les cellules MDCK avec le liquide de LBA (50 pi pour plaque de 96 puits ou 10 pi pour plaque 384 puits) ou virus PR8 avec des titres connus dans chaque puits avec un volume égal (50 microlitres par plaque de 96 puits ou 10 pl pour 384 – puits) de milieu DMEM,contenant de la L-1-tosylamido-2-phényléthyle cétone chlorométhyl (TPCK)-traitée la trypsine (0,2 ug / ml). Après 1 h d'infection, ajouter 100 ul (plaque de 96 puits) ou 20 pi (384 puits) de 10% de FBS contenant RPMI1640 milieu complet à chaque puits. Continuer à cultiver des cellules MDCK pour un autre h 16 de l'infection; laver les cellules MDCK deux fois avec 100 pi (plaque de 96 puits) ou 20 pi (384 puits) de PBS-1% solution de BSA et de fixer avec 100 pi (96 puits plaque) ou 20 pi (384 puits) de 1% de paraformaldéhyde pendant 5 min. Après fixation, incuber les cellules MDCK encore pendant 30 min avec 100 pi (plaque de 96 puits) ou 20 pi (384 puits) de BSA PBS-1% pour le blocage. Après le blocage incuber les cellules MDCK pendant 1 h avec l'anticorps primaire contre la protéine M2 (1:1000, dilué dans du PBS-BSA 1%). Utiliser 50 pi par ul bien et 20 de l'anticorps dilué par puits dans 96 puits ou 384 puits de plaques, respectivement. Laver les cellules MDCK trois fois avec 100 pi (plaque de 96 puits) Ou 20 pi (384 puits) de PBS contenant 1% de BSA et incuber pendant 1 h avec 50 pi (plaque de 96 puits) ou 20 pi (384 puits) de chèvre anti-souris IRDye @ 800 anticorps secondaire ( 1:200 de dilution). Laver les cellules MDCK trois fois avec 100 pi de PBS contenant 1% de BSA. Placez les plaques colorées sur la plate-forme de verre de lecture du scanner Odyssey LI-COR IR et mettre le lecteur pour un 96 – ou lecture des plaques de 384 puits. Vierges puits témoins négatifs peut être réglé en utilisant le logiciel Odyssey LI-COR. Quantifier plaque entière ou des puits sélectionnés dans la plaque en utilisant le logiciel Odyssey LI-COR. Utilisation de l'outil Forme automatique, tracer les frontières d'une région cible (ROI) au milieu d'un puits d'essai de 96 – ou 384-puits. Création d'un retour sur investissement permet au logiciel de comparer les puits de fond définies aux échantillons du virus-titrés. Pour définir la valeur de référence pour le dosage entier, utilisez un retour sur investissement de fond. Introduire les deux réticules opposées fournies par le logiciel Odyssée dans le retour sur investissement pour mesurer la vre l'intensité de la fluorescence dans l'ensemble du bien. Numérisation des plaques en utilisant 780 canaux nm pour la détection et de 680 nm comme longueur d'onde de référence dans un scanner Odyssey LI-COR IR. Une fois la commande 'Lecture' est activé, les intensités de fluorescence à des intervalles uniformes de la ROI sera mesurée et les données recueillies points intégrés. Un multiplicateur de l'écart-type sera de déterminer le niveau de signal sur la ligne de base qui est inclus dans la détermination ROI. Fluorescence de fond sera quantifié à partir de l'anticorps maquette infecté ou secondaire contrôle seule, et sera utilisé pour estimer l'intensité intégrée dans les puits d'essai. Choisissez 'intensité intégrée »pour les calculs, car il représente le volume net pixel pour une place définie individu et est indépendant de la dimension de l'élément. Utilisez la courbe standard à partir des titres viraux connus pour calculer les titres viraux des échantillons inconnus. Utilisez une courbe d'interpolation de temps pour calculer avec précision les titres viraux. Calculer la vtitres d'IRAL dans les échantillons d'épreuve by sont comparés les les intensités des échantillons d'essai avec la courbe standard. 4. Les résultats représentatifs Normalisation de l'IR à base de colorant système de détection virale élevée débit PR8 virus peut infecter les cellules MDCK, par conséquent, nous avons utilisé ces cellules pour développer ce test. Nous avons mesuré les titres viraux en utilisant un anticorps primaire contre une protéine de la matrice de la grippe virale (M2). Contrairement à d'autres méthodes, nous avons utilisé un anticorps secondaire est conjugué à un colorant IR proche. Cette méthode fournit un moyen simple, automatisée PR8 détermination du titre du virus en utilisant l'intensité de fluorescence qui est généré lors de la détection protéine M2. Après l'infection virus de l'influenza, protéine M2 est traduit d', transportés et s'accumule dans la cellule hôte y compris la surface de la cellule. Ainsi, la quantité de la protéine M2 représente un paramètre mesurable pour déterminer la quantité du virus. En comparant les intensités deles échantillons d'essai avec la courbe standard fournit la mesure précise de titres viraux. Pour déterminer l'efficacité de la méthode à base de fluorescence, nous avons cultivé des cellules MDCK 10 4 / puits dans la chambre de glisse pendant la nuit. PR8 stocks viraux de titres connus ont été ajoutés à des puits en double avec des unités différentes plaques de formage (UFP) et autorisé à s'adsorber sur les cellules pendant une heure. Les cellules ont été incubées pendant 16 h pour permettre au virus de se propager. Après cela, les cellules MDCK dans les diapositives de la chambre ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 1%, lavées et colorées avec des anticorps anti-M2 pour 1 h, suivie par AlexaFluor 488-conjugué anticorps secondaire pendant 1 h supplémentaire. Confocale analyses microscopiques de cellules infectées par MDCK démontré la monocouche adhérente était en grande partie intact et la protéine dérivée PR8-M2 était présent en abondance à l'intérieur des cellules infectées MDCK (figure 1A). Les cellules fluorescentes a pu être détecté dans les infections virales avec des titres aussi bas que 10 2 </sup>. Ces analyses ont également révélé que le nombre de cellules fluorescentes MDCK par puits ont été directement proportionnelle à l'augmentation des PR8 titres viraux. Bien que, le rendement optique d'excitation laser à l'argon-fluorochrome base fournit vives images cellulaires, son signal étroite par rapport au bruit et l'autofluorescence des cellules de rendre quantifications virales extrêmement difficiles, en particulier à basse titrages. Par conséquent, d'établir une méthode d'estimation précise virale nous avons utilisé un IR à base de colorant de détection et de quantification du système. Les cellules MDCK (10 4 / puits) ont été cultivées dans des plaques à 96 puits, infectés par le virus PR8 et des protéines virales ont été détectées à l'aide anti-M2 suivi par un colorant IR-anticorps secondaire conjugué. L'utilisation de l'anticorps anti-M2 nous a permis d'utiliser l'intensité de fluorescence spécifique de l'antigène comme une métrique directe de la quantité virale. Pour énumérer l'intensité de fluorescence, nous avons utilisé le LI-COR Odyssey à base de scanner IR. Ce système utilise deux canaux laser-based détections infrarouges pour identifier les fluorophores et de les différencier du bruit de fond. Le premier canal excite à 680 nm et émet à 700 nm pour aider à quantifier l'arrière-plan. Le second canal détecte fluorophores que excitent à 780 nm et émettent à 800 nm. Numérisation de PR8-infectés dans des cellules MDCK LI-COR Odyssey a indiqué une infection virale titre dépendant fluorescence brillante (figure 1B). M2 positifs fluorescents des cellules MDCK étaient clairement visibles à l'intérieur du puits (figure 1B). Une corrélation positive de l'intensité de fluorescence à titre de virus à partir de 10 2 -10 5 UFP pourrait être constamment observé. PR8 titrages viraux plus élevés que 10 6 PFU plomb à la mort cellulaire, qui fixe une limite supérieure pour la sensibilité du dosage. Positivité minimale détectable, mais toujours vu avec 10 2 -10 3 PFU PR8 titres viraux ont démontré la sensibilité élevée des colorants dans le proche infrarouge. Le rapport signal-bruit a été déterminée en comparant le mock-infectés ou isotypes d'anticorps traités des cellules MDCK. Ces deux contrôles abouti à des niveaux négligeables ou indétectables de fluorescence (figure 1B). Pour améliorer encore la sensibilité et de réduire les exigences d'essai d'échantillons de volume, nous avons infecté 5 × 10 3 cellules MDCK / puits dans 384 puits. PFU différentes de PR8 ont été testés comme un dilutions en série de log (figure 1C). La sensibilité de détection à partir de plaques de 384 puits était comparable à celle des essais de plaques à 96 puits. Les deux 10 1 et 10 2 PFU travaillé sans relâche de mieux dans les plaques de 384 puits par rapport à plaques à 96 puits. En utilisant les intensités de fluorescence à partir de 96 – ou des formats de plaques de 384 puits, nous avons construit des courbes de titrage standard (figure 1D). Dans ces calculs, la première variable est le titre viral tandis que le deuxième variable est l'intensité de fluorescence. Par conséquent, nous avons utilisé la distribution exponentielle pour générer une courbe-apte à détermine la relation polynomiale entre les titres viraux et des intensités de fluorescence. Nous avons également validé nos observations en utilisant un autre anticorps qui est dirigé contre la nucléoprotéine (NP) de virus PR8 (données non présentées). Sources distinctes de PR8 souches ont également été utilisés pour infecter les cellules MDCK qui ont été testés avec des anti-NP ou anti-M2 anticorps (données non présentées). Collectivement, nous concluons que IR à base de colorant système de détection de protéines peut aider à diagnostiquer l'infection des souches virales et précisément énumérer le titre des agents pathogènes infectieux. Considérations mathématiques pour le calcul des titres viraux Les calculs mathématiques de l'intensité de fluorescence et de déterminations du titre se fait comme décrit ci-dessous. Suite à la procédure de coloration, plaque entière ou des puits sélectionnés au sein de la plaque sont quantifiés à l'aide du logiciel Odyssey LI-COR. Utilisation de l'outil Forme automatique, les limites d'une région cible (ROI) a été élaboré au milieu des puits d'essai de 96 – ou 384-nousll plaques (figure 2A et B). Création d'un retour sur investissement permet au logiciel de comparer les puits de fond définies aux échantillons du virus-titrés. Un retour sur investissement de fond a été utilisé pour définir la valeur de référence pour le dosage entier. Deux opposés réticule (blanc) ont été introduits dans le retour sur investissement pour mesurer l'intensité de la fluorescence dans le puits (figure 2C). Courbes à le côté droit et ci-dessous les puits représentatifs dans la Figure 2C représentent l'intensité de les pixels le long de ces poils croisées. Les intensités de fluorescence à des intervalles uniformes de la ROI ont été mesurés et les points de données recueillies ont été intégrées. Un multiplicateur de l'écart-type déterminé le niveau de signal sur la ligne de base qui a été inclus dans la détermination ROI. Contexte de fluorescence a été quantifiée à partir de l'anticorps maquette infecté ou secondaire seul contrôles et utilisées pour estimer l'intensité intégrée dans les puits d'essai. Nous avons choisi l'intensité intégrée pour les calculs, car il représvolume de parents pixel nette pour une place individuelle définie et est indépendante de la taille caractéristique. En outre, intensité intégrée est sensiblement indépendante de la résolution. Intensité totale / pixel (I) correspond à l'intensité du signal résultant de l'. Cupule sélectionnée dans la zone de pixels (Est-) plus l'le signal résultant de l'arrière-plan de la zone de pixels (b) Par conséquent, pour le pixel «i»: I i = i S i + b i Volume de Pixel Taille d'représente à la fois l'ampleur du signal et de la zone dans laquelle il est distribué. Zone de signal d'est en relation avec la distribution de l'échantillon qui est générer le signal de. Le volume pixel est égal au signal total mesuré en pixel «i» dans la zone (a) du pixel fois sa hauteur (I). Donc, pour le pixel «i»: vi = a I i Le volume total de pixels est la somme du signal total de toute la zone ainsi: ; n n V = Σv i = aΣI i i = 1 i = 1 Intensité intégrée est la somme de les valeurs d'intensité de tous les pixels délimitées par les fonctionnalité, multiplié par l'aire du cercle / rectangle de (mm comte 2). Par conséquent, l'intensité intégrée = un (ΣI i – b) Ici, b représente l'intensité du pixel de fond moyen. Cette formule calcule les intensités des signaux intégrés de contrôle ou des puits expérimentaux et établit ainsi une courbe standard. Les titres viraux dans les échantillons d'essai ont été calculées à l'aide de cette courbe standard. Opération de concentration (de l'intensité) est définie comme la quantité de présents de fluorescence dans un retour sur investissement défini. Les concentrations dans les échantillons d'essai sont calculpar rapport à Ted les concentrations définies par les normes en la même image. Pour calculer les titres d'précises virales, l'intensité de chaque norme de concentration est tracée et équipé d'une courbe d'interpolation à long. Les concentrations des échantillons de test sont calculées en comparant l'intensité de la zone à l'intérieur de la courbe standard. Détermination de titres viraux dans le liquide BAL de souris infectées par la grippe La détection de particules virales de la grippe en direct dans des échantillons cliniques et de laboratoire est d'une importance critique. Par conséquent, nous a ensuite examiné si nous pouvons utiliser cette méthode pour déterminer les titres viraux dans les échantillons de laboratoire. Liquides de LBA ont été recueillies à partir de souris non immunisées et dopé avec une quantité connue de virus PR8. Pointes liquides de LBA ont été linéairement titré de l'énumération des titres viraux. Des aliquotes de pointes liquides de LBA ont été utilisés pour infecter les cellules MDCK en plaques à 96 puits, fixées et colorées avec des anticorps anti-M2 et IR colorant conjugué secondard'anticorps y. Les résultats présentés dans la figure 3A démontrer que les titres viraux dans le liquide enrichi BAL étaient détectables et en corrélation avec les PR8 titres dans la courbe standard. Utilisation de la courbe standard, le nombre précis virales dans le liquide enrichi et titré BAL a été quantifiée. Exponentielles calculs d'ajustement de courbe a fourni une mesure de calculer les titres viraux dans le liquide enrichi BAL (figure 3B). Grâce à cette méthode, nous avons obtenu d'excellents corrélations entre les titres calculés et dopé virales, la validation de cette approche (figure 3C). Ensuite, nous avons analysé le liquide BAL de PR8-souris infectées. PR8 a été largement utilisé dans des modèles murins pour comprendre l'immunité humaine 3 pathologie et anti-virale. Des groupes de souris ont été infectées par voie intranasale avec 5.000 PFU de PR8. Les souris ont été suivis pendant une perte de poids, l'apparence de dos voûté, la fourrure ébouriffée et d'autres symptômes cliniques. Les jours 0, 2, 4, 7 et 10 de la post-infection,souris ont été sacrifiées et liquides de LBA ont été recueillies. Pour utiliser ces échantillons de laboratoire, des cellules MDCK ont été incubées avec des dilutions successives de liquide de LBA dans un volume final de 50 ul pendant 17 h dans des plaques 96 puits. Puits de contrôle de cellules MDCK infectées avec des titres connus de stock virus PR8 servi à générer une courbe standard. Après l'infection, les cellules ont été lavées, fixées et colorées avec des anticorps anti-M2 primaire, suivis par le proche infrarouge colorant conjugué anticorps secondaire. Les cellules MDCK qui étaient maquette infectés ou traités avec des contrôles d'isotype après l'infection à condition que les intensités de fluorescence de fond pour les calculs du titre. Les analyses de la liquide de LBA a démontré que le virus PR8 dans l'échantillon de laboratoire est détectable par le système de dosage IR à base de colorant. Une augmentation significative de la charge virale dans le liquide de LBA a été observée aux jours 2 et 4 après l'infection (figure 4A). Les calculs de l'intensité intégrée a indiqué que les fluides de BAL jours 2 et 4 de i posternfection contenaient des niveaux importants de virus PR8 (figure 4B). Nos résultats montrent une perte de poids progressive mais significative au cours de la phase précoce de l'infection PR8, ce qui démontre la gravité de la maladie. Néanmoins, la plupart des souris commencé à se redresser à partir de symptômes de la maladie et la prise de poids 7 jours après l'infection (figure 4C). Souris à jour 10 après l'infection n'avait aucune PR8 détectable indiquant la clairance du virus, qui a également corrélée avec l'augmentation du poids corporel et des réductions considérables dans les symptômes de la maladie. Pour étendre l'application de ce test, nous avons testé une année 2009 de la grippe A (H1N1) humaine isoler avec IR à base de colorant système de détection d'anticorps et l'a comparé en temps réel PCR. Cet échantillon clinique a été isolé à partir d'un écouvillon nasopharyngé combiné / obtenu à partir de la gorge du patient suspect. L'isolat a été propagé dans une lignée cellulaire MDCK au Laboratoire Milwaukee Département de la santé. Les résultats des tests étaient comparablesrouge pour vérifier la sensibilité de l'IR à base de colorant méthode en temps réel aux tests de PCR (Figure 5). Les résultats indiquent que l'IR à base de colorant système de détection d'anticorps a le potentiel pour détecter la charge virale aussi bas que 10 3 DICT 50 / ml, ce qui est comparable à la PCR basée sur dosage (10 DICT 50 / ml) et à l'automne au sein de la pertinence clinique gamme pour la plupart des échantillons de patients. Ces résultats fournissent des preuves solides que le système de dosage IR à base de colorant a une sensibilité suffisante et le potentiel pour être appliqué pour le dénombrement titre viral dans le laboratoire de recherche et les paramètres cliniques. Figure 1. IR à base de colorant de détection immunitaire des virus de la grippe. (A) confocale analyses microscopiques de la grippe infectées par les cellules MDCK dans les diapositives de la chambre 8-même. Immunofluorescence des analyses microscopiques démontrer la monocouche adhérente MDCK est en grande partie intacte et chargé par le virus dérivé de M2 protéines. (Colombie-Britannique) Quantification des titres viraux basés sur IR colorant et le système Odyssey LI-COR. (D) Génération de courbes exponentielles standard et la courbe-ajustement des profils. Les données présentées dans AD sont représentatifs de cinq expériences indépendantes. Figure 2. Méthodologie de la détermination de titres viraux utilisant des colorants IR. (A) intégrés mesures d'intensité de fluorescence. Un zone définie à l'intérieur du puits d'essai (retour sur investissement) a été marquée pour mesurer les intensités de fluorescence. Utilisation de l'outil Forme automatique, les limites de la ROI ont été établis dans le milieu des puits d'essai de 96 – ou 384 puits plaques. Fluorescence a été mesurée sous forme de pixels individuels (pixel = n) au sein de la ROI. Intensité intégrée est la somme de les valeurs d'intensité de tous les pixels délimitées par les fonctionnalité, multiplié par l'aire du cercle / rectangle de (mm comte 2). (B) Détermination des intensités de fluorescence intégré dans chaque puits. Création d'un retour sur investissementa permis le scanner LI-COR pour comparer les puits de fond définies aux échantillons du virus-titrés. Contexte de fluorescence a été quantifiée à partir de l'anticorps maquette infecté ou secondaire seul contrôles et utilisées pour estimer l'intensité intégrée dans les puits d'essai. (C) Collection de points de données au sein de la ROI. Deux opposés réticule (blanc) ont été introduits dans le retour sur investissement pour mesurer l'intensité de la fluorescence dans le puits. Courbes à le côté droit et ci-dessous les puits représentatifs représentez l'intensité de les pixels le long de ces poils croisées. Figure 3. Détection et quantification des titres de virus dans les liquides de LBA PR8 pointes. (A) des cellules MDCK ont été cultivées dans des plaques 96 puits pendant la nuit et a ajouté avec PR8-pointes liquide de LBA. Les plaques ont été lues dans le système Odyssey LI-COR. (B) exogène fluide enrichi BAL a été comparée avec les courbes standard. (C) Comparaison des calculée à vir devrait titres al. Ajustement de la courbe exponentielle y = 9.4784e fourni 0.0014x. Les données présentées dans AC sont représentatifs de trois expériences indépendantes. Figure 4. Détection et quantification des virus de la grippe dans les fluides de BAL PR8 souris infectées. (A) Des groupes de souris ont été infectées par voie intranasale avec 5.000 PFU de PR8. Les cellules MDCK ont été incubées avec des dilutions successives de liquide de LBA dans un volume final de 50 ul pendant 17 h dans des plaques 96 puits. Après l'infection, les cellules ont été lavées, fixées et colorées avec des anticorps anti-M2 anticorps primaire suivie par IR colorant conjugué anticorps secondaire. Le panneau de droite représente la courbe standard. (B) Quantification des titres viraux dans le liquide BAL des souris infectées. La perte de poids (C) des souris au cours PR8 l'infection corrélée avec la charge virale. Les données présentées dans AC sont représentatifs de trois expériences indépendantes. re 5 "src =" / files/ftp_upload/3623/3623fig5.jpg "/> Figure 5. Détection et la quantification de l'année 2009 A (H1N1) (pdm) isolat de l'influenza à partir d'un patient humain. (A) Le IR à base de colorant système de détection d'anticorps par fluorescence pour la demi-fois le titrage de lignée cellulaire infectée MDCK. Les résultats de fluorescence indiquent un dosage a un potentiel pour détecter la charge virale aussi bas que 10 3 DICT 50 / ml. (B) l'acide nucléique extrait de la culture d'isoler avec de série de dix dilutions de quelques H1N1 connus titrés isolat ont été analysés avec la CDC en temps réel PCR 12. La limite de détection pour les PCR en temps réel a été de 10 DICT 50 / ml.