İnsan Protein Atlas içinde Doku Mikroarray'ler, İmmünohistokimya Boyama ve Sayısallaştırma Üretimi

1. Doku Mikroarray Üretim için dokular nasıl hazırlanır (Animasyon 1) Karşılık gelen hematoksilen lekeli doku bölümü de dahil olmak üzere ilgili formalin sabit parafin malzeme (doku ya da hücre örnekleri) seçin. Doku bölümünde ilgili bölümü işaretleyin. Bu parafin blok karşılık gelen bir yeni kesilmiş hematoksilen lekeli bölümü olması tavsiye edilir. TMA üretimi için kullanılan şablonu tasarlayın. Örneğin, bütün TMA bölümü ve kesit sorunlar üzerinde antikor kapsama gibi teknik sorunlardan kaynaklanan eserler önlemek için şablon içinde örnekleri Rastgele. Yönlendirme için şablonuna ek yönlendirme işaretleri ekleyin. Şablona göre dokuların düzenleyin. 2. Manuel Doku Mikroarray Üretim (çekim için Temel) , Doku çekirdek standart bir uzunluk elde stileyi örneğin 4.5 mm (Şekil 2) işaretlemek için edebilmek. GuidelÖrnek merkezleri arasındaki mesafe için ines: çekirdek büyüklüğü 0,6 mm – 0.8-1.0 mm Çekirdek boyutu 1.0 mm – 1.8-2.0 mm çekirdek büyüklüğü 1,5 mm – 2.0-3.0 mm Çekirdek boyutu 2.0 mm – 2.5-4.0 mm Bu parafin çatlamasını önlemek için parafin blok her iki tarafında 2.5-3.0 mm kenar boşluğu bırakmak önerilir. Kullanılmak üzere seçilen delgeçler monte edilir. Yerde yumruk tutan altıgen soket vida gevşeterek başlayın. Yumruk hub oluk sıkıca v-blok plastik metal çubuk karşı yerleştirildiğinde yumruk doğru konumlandırılmış. Vidaları ve metal klibin kenarı yatay olduğundan emin olmak. Alıcı yumruk sola yerleştirilmelidir (yeşil ve kırmızı, distribütör için özel olarak işaretlenmiş). Donör yumruk biraz daha büyük bir çapa sahip olan, (Şekil 3) sağa doğru konulmalıdır (yeşil ve mavi, distribütör için özel olarak işaretlenmiş). XY ayar dügmesini kullanarak x ve y eksenleri boyunca yumruklar taşıyın. Doğru ayar düğmesi x ekseni boyunca hareket yumruklar ve sol ayar düğmesi y ekseni boyunca yumruklar taşır. Ayarlaması kolları hem dijital bir mikrometre okuma vardır. Kolları hareket ettirirken Bu aktive edilir. Reset → SIFIR / ABS düğmesine basın. Inç ve mm arasında Shift → / aa IN düğmesine basın. Bir 9×8 şablon için bir 1 mm zımba kullanıldığında delikleri arasındaki boşluk 2.0 mm (delik merkezleri arasındaki ölçülen) olmalıdır. Kaset vurmak ve yumruk yok, sen blok içine çok aşağı yumruk itmeyin sağlamak için, tutucu içinde parafin olmadan bir kaset koydu ve kaset alt yukarıdaki 1 mm alıcı yumruk alt konumunu ayarlamak az derin stop vidasından kullanılarakZ-kılavuz sol üst köşesinin (Şekil 3). Tutucu alıcı blok koyun ve vidaları sıkıştırmak için küçük bir tornavida kullanın. Sıkı vidaları sıkıştırın etmeyin ya da parafin kasetinden kurtulacağım olabilir. Alıcı blok içine aşağı alıcı yumruk yaklaşık 5 mm itin ve (Şekil 3) kez ileri ve geri döndürmek için yumruk yumruk kolu kullanın. Mümkün olduğunca blok içine kadar aşağı yumruk iterken delik 5 mm derinliğinde olacaktır. Yaylar yumruk yukarı taşımak, böylece yavaş yavaş aşağı doğru iterek basıncını tahliye edin. Yumruk boşaltmak ve parafin çekirdek atmak için stileyi kullanın. Donör delme (Şekil 3) geçmek için taret taşıyın. Alıcı blok tutucu üzerinden donör blok (Şekil 3) ile donör blok köprü yerleştirin. Donör Nokt itindonör bloğun seçilen alana h. Karşılık gelen hematoksilen ve faiz bölgeye örnek olmaktır doku bulmak için imlenmiş eozin slayt kullanın. El sol elinizle pozisyonda donör blok tutun ve sağ elinizle yumruk itin. Eğer Stile üzerinde itmek gerektiğini unutmayın. Derinlik donör blok için uygun konumda yumruk hareketi engellemek değil, bu nedenle ikinci işareti Stile üzerinde görünür olduğunda bastırıyor durdurmak önemlidir. Bir kez yumruk (Şekil 3) kolu çevirin. Hala donör blok köprü donör blok tutarak yavaşça aşağı doğru basınç bırakın. Donör doku tercihen alıcı çekirdek daha kısa 0.5 mm delikli edilir. Bu proses değerli temsili doku kaybı kaçınarak, alıcının blok yüzeyinde göbeklerin ayarlanabilir bir uyum sağlar. Köprü ve donör blok çıkarın. Yapmakdonör yumruk (nokta 4) daha önce yapılmış delik ile uyumlu olduğundan emin olun. Siz donör yumruk ve alıcı blok delik uyumlu değilse ayarlayın vidaları kullanarak yumruk konumunu ayarlamak gerekir. Ucu alıcı blok deliğin üst ulaşıncaya kadar dikkatlice aşağı yumruk itin. Bu pozisyonda tutarken, deliğe doku çekirdek boşaltmak için stileyi kullanın. Çekirdek yüzeyi blok yüzeyi ile aynı hizada olacaktır. Alıcı yumruk taret geri hareket ettirin. XY ayar düğmeleri ile bir sonraki konuma gider. Dizi tamamlanana kadar yukarıdaki noktası 4c itibaren tekrarlayın. Tüm alıcı blok bittiğinde alıcı blok tutucu vidayı gevşetin. 40 dakika süreyle 42 ° C blok pişirilir. Cam bir slaytta aşağı bakacak kesit alanı ile blok koyun. Bir test tüpü sahibi (veya uygun başka inşaat) ve t yer üstüne bloğu ile cam slayt yerleştirindiye fırınlayın. Pişirme sonra fırından test tüpü tutucusunu çıkarın ve yavaşça cam slayt okşayarak tarafından blok yüzeyine düzleştirin. 10 dakika boyunca bir soğutma cam plaka üzerine kayar ile blok yerleştirin. TMA boyunca temsilcisi doku sağlamak için her 50. bölümünde bir kalite kontrolü yapılır. 3. Nasıl Bölüm TMAlar (Animasyon 2) Bölümüne transfer sistemi (HM 355S, Microm) ile bir mikrotom kullanarak 4 mikron kalınlığında kesitler kesin. Sistem tüm döner Mikrotomlar ile birlikte kullanılabilir. Sistemi entegre transferi köprü, ısıtılmış bir su banyosu ve bir kontrol ünitesi ile bir bıçak taşıyıcı oluşur. Bıçaklı bölümlerde su banyosuna bir transfer köprü ile ıslak transfer yüzeyi üzerinde kayar. Bölümler bunlar hassas doku noktalar (göğüs ve beyin gibi örneğin lipid zengin dokular) erimesi önlemek için, uzattığınız hemen sonra su banyosu alınmalıdır. PlaBir SuperFrost cam slayt üzerine ce bölümü. Bölümler su içinde bırakılabilir zaman parafin tipi kullanılan ve suyun sıcaklığı mumlu bağlıdır. ° C ve 37-39 arasında bir su banyosu sıcaklığında önermektedir ° C'de 56-58 arasında bir erime noktasına sahip HistoLab Products A, bizim laboratuar kullanımı parafin Gece boyunca oda sıcaklığında (RT) kurutma için bir kayar tutucuya slaytlar yerleştirin. Slaytlar 12-24 saat süreyle 50 ° C fırınlanır. Eğer bir fırça gibi kullanarak el bıçaklı bir su banyosuna bölümüne taşımak zorunda STS olmadan Mikrotom kullanma. 4. Test ve İmmünohistokimya için Titrasyon Prosedürü (Animasyon 3) Her bir antikor doku ve farklı hücre tipleri bir karışımını içeren özel olarak tasarlanmış TMAlar kullanılarak standart bir test prosedürü tabi tutulur. Amaç her antikor için bireysel ve optimize immun protokolü değerlendirmektir. Karınca dayalı Başlangıçta bir seyreltme,Primer antikor ibody stok konsantrasyonları test edilir. Bu test boyamanın sonucu protokol daha dilüsyonları ve optimizasyon yönlendirmek için kullanılır. Damıtılmış su ksilen ve dereceli etanol içinde Deparaffinization ve hidratasyon İmmünoboyama önce gerçekleştirilir. Endojen peroksidaz gidermek için bir engelleme adım 5 dakika süreyle% 95 etanol içinde% 0.3 H2O 2 gerçekleştirilir. Isı Induced epitop Alım (Hier) 125 azından 4 dakika boyunca ısı kaynağı olarak bir basınç kazanı (Decloaking odacık, Biocare Medical) kullanılarak ° C'de, bir tampon, pH değeri alımı 6 gerçekleştirilir Kaynama tamamlandıktan sonra, kaydıraklar basınç kazanı kalır ve 90 soğumasına izin verilir ° C. Hier için toplam işlem süresi yaklaşık 45 dakikadır. Hiçbir kesin sonuç ilk testte elde edilirse, daha ileri testler gözlenen boyanma paterni 5 6 dayalı yapılır. Pilot çalışma, HPA yüksek verimli set-up içinde gösterdiBu Hier pH 6, ancak bu tür proteinaz, mikrodalga ve daha yüksek veya daha düşük bir pH ile tampon içinde kaynatma ile ön-inkübasyon gibi diğer yöntemler alma tabii kullanılabilir en yararlı antijeni alma. Antikor inkübasyon sürelerinde, antikor dilüsyonları ve diaminobenzidin (DAB), inkübasyon zaman değişiyor IHC durum örneğin değiştirerek boyama desen daha kesin sonuçlar verebilir. 5.. Boyama Programı, Autostainer 480 (Thermo Fisher Scientific) Bütün inkübasyonlar, RT gerçekleştirilir ve bu protokol aynı reaktifleri ile manuel bir ayar olarak da kullanılabilir. Yıkama tamponu içinde çalkalayın. 5 dakika boyunca Ultra V bloğu ile inkübasyondan. Yıkama tamponu içinde çalkalayın. 30 dakika için primer antikor ile inkübasyondan. Yıkama tamponu (x2) yıkayın. 30 dakika etiketli turbu peroksidaz-polimer ile Kuluçka. Yıkama tamponu (x2) yıkayın. DAB çözüm geliştirilmesi10 dakika için. Yıkama tamponu (x2) yıkayın. 5 dakika için * Mayers hematoksilin Counterstaining. Progresif bir boyama yöntemi kullanılarak zaman (örn. Mayers hematoksilin) ​​yoğunluğu zaman bağlıdır ve herhangi bir farklılaşma gereklidir. Bir gerici boyama yöntemi örneğin Harris hematoksilen bir yapı vurgulamak amacıyla dokuların aşırı boya kaldırmak için farklılaşmayı gerektirir. Musluk suyu * yıkayın. Lityum karbonat suda durulayın, 1 dakika * için doymuş çözeltisi ila 1:5 seyreltilmiş. * 5 dakika için musluk suyunda yıkayın. Slaytlar dereceli etanol içinde susuz ve slaytlar (PERTEX, Histolab) dakika muamele edilir Tüm reaktifler slayt başına 300 ul bir ses seviyesinde uygulanır. * Adımlar 10-14 bir histostaining enstrüman (Autostainer XL, Leica) yapılır ve coverslipping ayrıca bir coverslipper sistemi (otomatik cam coverslipper CV5030, Leica) yapılır. 6. Tarama nasılBir Slayt Tarama slayt yöntemi kullanılmaktadır dijital tarayıcı bağlıdır, bu protokolü sadece otomatik tarama sistemi Aperio XT (Aperio Teknolojileri) kullanarak slayt tarama nasıl tanımlar. Için İnsan Protein Atlas set-up 20x büyütme, doku ve hücreler için 40x kullanılır. Otomatik bir tarama doku heterojen bir TMA dahil çeşitli dokularda sayısına bağlı olarak odak sorunlarla olabilir. Kir, tutkal ve cam slayt temizleyin ve coverslip ve bölüm arasında hava kabarcığı olup olmadığını kontrol edin. Hava kabarcıkları gerilemek slayt halinde. Rafa slayt koyun ve dijital tarayıcı rafa yerleştirin. 20x büyütmede TMA tarama süresi yaklaşık 6 dakikadır. Aperio gelen bir yazılım ilgi alanını seçmek için kullanılır. Odak noktası seçimi yazılım içinde otomatik olarak yapılır. Elle tarama alanı ve odak noktalarının seçiminde de mümkündür. Görüntü saat sonraoluşturulan olarak değerlendirilmesi ve IHC lekelenmesi açıklama amacıyla kullanılabilir. Görüntüler deney sonucunda dosya olarak kalır ve tartışmalar için arkadaşları dağıtılmış olabilir ve daha fazla veri yayımlama için kullanılır. Görüntüleri Aperio bir serbestçe kullanılabilir yazılım görülebilir. 7. Nasıl İnsan Protein Atlas Sık Protein ara ile Gidin www.proteinatlas.org. Favori protein, Ensemble'da id, UniProt üyelik numarası veya HGNC adı örneğin insülin adını girin. Özet sayfası girin ve normal doku ve organ özeti gidin. Genel pankreas protein ifadesini gösterir. "Fazla doku veri" tıklayın. Sen bütün dokularda organı sıralaması dahil görebileceğiniz normal dokuları görüntülemek girin. Aynı protein yönelik 3 antikorları için İHK sonuçları görmek için pankreas tıklayın. Bir hi görüntülemek içingörüntü üzerinde pankreas tıklayın gh-çözünürlüklü görüntü. Kanserli doku, hücre ve İnsan Protein Atlas içinde başka doğrulama, veri protein ekspresyonu ile ilgili ek bilgiler İnsan Protein Atlas web sitesinde gezinirken bulunabilir. 8. Temsilcisi Sonuçlar Animasyon 1. Nasıl doku mikroarray üretimi için dokuların hazırlanması. Animasyon 1 görmek için buraya tıklayın . Animasyon 2. Nasıl bölümüne TMAlar için. Animasyon 2 görmek için buraya tıklayın . Animasyon 3. Immünhistokimya tekniği tarif edilmiştir. Animasyon 3 görmek için buraya tıklayın . Şekil 1. Insan proteini Atlas Uppsala içinde işlemi Genel şeması. Doku çekirdek standart uzunluğu için işaretlenmiş Şekil 2. Donör stileyi 4.5 mm gibi. Şekil 3. Manuel doku microarrayer. Şekil 4. Üretilen TMAlar farklı kalite örnekleri. (A) düz ve düzgün satır ve sütun gibi parafin kenarına arasında yeterli boşluk ile TMA hizalanır. (B) çekirdek bazıları ile bir TMA çok kesit zaman olası güçlüklere yol kenarına yakın. (C) bir TMA t pişirilir edilmiş olduğuoo uzun doğru şablonu olmadan çökmüş TMA sonuçlanır. Şekil 5. Hematoksilen ve eozin TMAlar. Düz ve hizalı sütun ve satır ile (A) düzgün kesilmiş bölümü. Kötü ya da kirli bıçak kullanarak yarma (B) veya sıkıştırılmış bölümleri (C) neden olabilir. Şekil 6. Antikorların titrasyon. (A) lenf düğümü hücreleri Reaksiyon merkezi geçmişi olmayan özel bir sitoplazmik boyanması (kahverengi gösterildiği gibi) ile sonuçlanan bir optimum titre antikoru gösterir. (B) doku bölümü zayıf bir boyama gösterir. Negatif ya da zayıf bir boyama primer antikorun konsantrasyonunu hedef protein immunohistokimyasal dokularda mevcut değildir çok düşük olduğunda veya bulunur. (C) doku bölümü primer antikorun çok yüksek konsantrasyonda kullanılması nedeniyle overstained edilir. D, taşmak reaktivite ve yanlış pozitiflik geçmeye nedeniyle Subselüler yerini belirlemede zorluklar içinde gemi renk sonuçlar.