La producción de microarrays de tejidos, las técnicas de inmunohistoquímica y la digitalización En el Human Protein Atlas

1. Cómo preparar los tejidos para la producción de microarrays de tejidos (Animación 1) Seleccione el material pertinente formol fija parafina incrustado (muestras de tejido o célula), incluyendo la sección de tejido correspondiente hematoxilina manchado. Marcar área correspondiente de la sección de tejido. Se recomienda tener un recién cortado la sección teñida con hematoxilina correspondiente al bloque de parafina. Diseño de la plantilla que se utiliza para la producción de TMA. Selección aleatoria de las muestras dentro de la plantilla para evitar los artefactos causados ​​por problemas técnicos, como la cobertura de los anticuerpos en toda la sección TMA y los problemas de seccionamiento. Agregar marcadores adicionales de orientación a la plantilla para la orientación. Organizar los tejidos de acuerdo a la plantilla. 2. Tejido Manual de Producción de microarrays (esencial para la filmación) Para poder obtener una longitud normalizada de los núcleos de tejido, marcar el estilete por ejemplo 4,5 mm (Figura 2). Guidelines de distancia entre ejes de la muestra: tamaño del núcleo de 0,6 mm – 0,8-1,0 mm centrales de tamaño 1.0 mm – 1,8-2,0 mm tamaño del núcleo de 1,5 mm – 2,0-3,0 mm núcleo de tamaño de 2,0 mm – 2,5-4,0 mm Se recomienda dejar 2,5-3,0 márgenes mm en cada lado del bloque de parafina para evitar el agrietamiento de la parafina. Montar los golpes seleccionados para ser utilizados. Comience por aflojar los tornillos de cabeza hueca hexagonal que sostiene el golpe en su lugar. El punzón está en posición correcta cuando la ranura en el centro punzón está firmemente colocado contra la barra de metal en el plástico de v-bloque. Fijar los tornillos y asegurarse de que el borde del clip metálico es horizontal. El golpe receptor (marcado en verde y rojo, específica para el distribuidor) debe ser colocado a la izquierda. El punzón donante (marcado en verde y azul, específico para el distribuidor), que tiene un diámetro ligeramente mayor, se debe colocar a la derecha (figura 3). Mueva los golpes a lo largo de los x-e y los ejes mediante el uso de los botones de ajuste XY. La perilla de ajuste de la derecha mueve los golpes a lo largo del eje X y el botón de ajuste de la izquierda se mueve los golpes a lo largo del eje. Hay una lectura micrómetro digital en ambos mandos de ajuste. Estos se activan cuando se mueve los mandos. Restablecer → pulse el botón ZERO / ABS. Cambio entre pulgadas y mm → pulse el botón IN / mm botón. El espacio entre los agujeros deben ser de 2,0 mm (medida entre los centros de los agujeros) cuando se utiliza un punzón 1 mm para una plantilla de 9×8. Para asegurarse de que no insista en el golpe demasiado abajo en el bloque, llegando a la bandeja y la destrucción de la perforadora, poner un casete sin la parafina en el soporte y fijar la posición de fondo del recipiente golpe a 1 mm por encima de la parte inferior de la bandeja mediante el tornillo de tope de profundidad en elesquina superior izquierda de la Z-guía (Figura 3). Coloque el bloque receptor en el soporte y utilizar la menor destornillador para apretar los tornillos. No apriete los tornillos demasiado apretada o la parafina podría liberarse de la cinta. Empuje el golpe receptor hacia abajo aproximadamente 5 mm en el bloque receptor y usar el mango en el golpe para hacer girar el punzón de ida y vuelta una vez (Figura 3). El agujero será de 5 mm de profundidad al empujar el punzón tan abajo en el bloque como sea posible. Aliviar la presión hacia abajo empuja lentamente, de modo que los resortes se puede mover el punzón hacia arriba. Utilice el estilete para vaciar el punzón y sacarles las semillas de parafina. Mover la torreta para cambiar a la donante punzón (Figura 3). Coloque el puente bloque donante con el bloque de donantes sobre el soporte del bloque receptor (Figura 3). Empuje la punción de los donantesh en el área seleccionada del bloque donante. Utilizar una correspondiente hematoxilina y eosina diapositiva manchado donde ha sido la región de interés marcado para localizar el tejido que es objeto de muestreo. Manual de mantener el bloque de los donantes en la posición con la mano izquierda y empuje el golpe con la mano derecha. Tenga en cuenta que no debe presionar sobre el estilete. El tope de profundidad no bloquea el movimiento de golpe en la posición adecuada para el bloque de los donantes, por lo que es importante que dejas de empujar cuando la segunda marca es visible en el estilete. Gire el mango en el golpe una vez (Figura 3). Suelte lentamente la presión a la baja, mientras que mantiene el bloque de los donantes en el puente de bloqueo de los donantes. El tejido del donante está preferiblemente perforada 0,5 mm más corta que el núcleo receptor. Este proceso se asegurará una alineación ajustable de los núcleos en la superficie del bloque receptor, evitando la pérdida de tejido representante valioso. Quitar el puente y el bloque de donantes. Hacerasegurarse de que el donante punzón está alineado con el agujero que se hizo anteriormente (punto 4). Debe ajustar la posición de perforación utilizando los tornillos de fijación si el golpe de los donantes y el agujero en el bloque receptor no están alineados. Cuidado empuje el punzón hacia abajo hasta que su punta alcanza la parte superior del agujero en el bloque receptor. Mientras se mantiene esta posición, utiliza el estilete para vaciar el núcleo de tejido en el agujero. La superficie del núcleo debe estar en alineación con la superficie del bloque. Vuelva a colocar el revólver con el punzón destinatario. Mover a la siguiente posición con los botones de ajuste XY. Repetir desde el punto 4c anteriores hasta que la matriz es completa. Cuando el bloque receptor de que se complete, afloje los tornillos en el soporte del bloque receptor. Hornee el bloque de 42 ° C durante 40 minutos. Colocar el bloque con el área de seccionamiento hacia abajo sobre un portaobjetos de vidrio. Colocar la placa de vidrio con el bloque en la parte superior de un soporte para tubos de ensayo (o de construcción adecuado) y el lugar en tél horno. Después de la cocción, quitar el soporte del tubo de ensayo del horno y aplanar la superficie del bloque por acariciando suavemente el portaobjetos de vidrio. Coloque el bloque con la placa de vidrio sobre una placa de enfriamiento durante 10 minutos. Para asegurar el tejido representante de todo el TMA un control de calidad en cada sección de 50 º se lleva a cabo. 3. Cómo TMA Sección (Animación 2) Cortar 4 micras de grosor, con un microtomo con el sistema de transferencia de la sección (SM 355S, Microm). El sistema puede ser utilizado con todos los microtomos rotativos de corriente. El sistema consta de un soporte de cuchilla con puente de transferencia integrado, un baño de agua caliente y una unidad de control. De la hoja de las secciones se deslizan sobre la superficie de transferencia húmedo a través de un puente de transferencia en el baño de agua. Las secciones se deben tomar de un baño de agua inmediatamente después de haber tendido, para evitar la fusión de los puntos sensibles del tejido (tejidos ej. ricas en lípidos como el pecho y el cerebro). Place la sección sobre un portaobjetos de vidrio SuperFrost. El tiempo de las secciones puede ser dejado en el agua depende del tipo de parafina encerado utilizado y la temperatura del agua. Nuestro uso de laboratorio de cera de parafina de HistoLab Products AB, que tienen un punto de fusión de 56-58 ° C y se recomienda una temperatura de baño de agua de 37-39 ° C. Colocar los portaobjetos en un soporte de diapositivas para el secado de la temperatura ambiente (TA) durante la noche. Los portaobjetos se cuecen en 50 ° C durante 12-24 horas. El uso de un micrótomo STS, sin que usted tenga para el transporte de la sección de la hoja de un baño de agua de forma manual, por ejemplo usando un pincel. 4. Prueba y Procedimiento de valoración de inmunohistoquímica (Animación 3) Cada anticuerpo se somete a un procedimiento de ensayo normalizado utilizando especialmente diseñados TMA que contienen una mezcla de tejidos y diferentes tipos de células. El objetivo es evaluar un protocolo de inmunotinción individual y optimizado para cada anticuerpo. Inicialmente una dilución, basado en hormigaconcentración ibody de stock del anticuerpo primario se ensaya. El resultado de esta prueba de tinción se utiliza para guiar a otras diluciones y la optimización del protocolo. Desparafinización y la hidratación en etanol y xileno clasificado al agua destilada, se llevan a cabo antes de la inmunotinción. Un paso de bloqueo para saciar peroxidasa endógena se realiza en 0,3% de H 2 O 2 en etanol al 95% durante 5 minutos. El calor inducido Epítope (HIER) se lleva a cabo en un tampón de pH 6 recuperación, utilizando una caldera de presión (cámara de destape, Biocare Médica) como fuente de calor durante 4 minutos a 125 ° C. Después de completado de ebullición, las diapositivas permanecen en la caldera de presión y se deja enfriar a 90 ° C. El tiempo total de procesamiento para HIER es de aproximadamente 45 minutos. Si no hay ningún resultado concluyente se obtiene en la prueba inicial, las pruebas que se realicen más basado en el patrón de tinción observado 5 6. Un estudio piloto, dentro de la HPA de alto rendimiento de la configuración, mostróque la recuperación de antígenos más útil donde HIER pH 6, pero otros métodos de recuperación, tales como la pre-incubación con proteinasa, microondas y ebullición en tampón con un pH superior o inferior puede por supuesto ser utilizado. Al cambiar la condición de IHC, por ejemplo cambio de los tiempos de incubación de anticuerpos, los anticuerpos y diluciones diaminobencidina (DAB) los tiempos de incubación el patrón de tinción puede dar resultados más concluyentes. 5. Programa de tinción, Autostainer 480 (Thermo Fisher Scientific) Todas las incubaciones se realizan a temperatura ambiente y este protocolo también se puede utilizar en una configuración manual con los mismos reactivos. Enjuague con tampón de lavado. La incubación con Ultra bloque V durante 5 minutos. Enjuague con tampón de lavado. La incubación con el anticuerpo primario durante 30 minutos. Enjuague con tampón de lavado (x2). La incubación con peroxidasa de rábano picante etiquetada-polímero durante 30 minutos. Enjuague con tampón de lavado (x2). El desarrollo en la solución de DABdurante 10 minutos. Enjuague con tampón de lavado (x2). Contratinción de hematoxilina de Mayers 5 minutos *. Cuando se utiliza un método de tinción progresiva (por ejemplo, hematoxilina Mayers) la intensidad depende del tiempo y no hay diferenciación es necesaria. Una tinción regresiva por ejemplo, método hematoxilina de Harris requiere la diferenciación para eliminar el exceso de tinte de los tejidos con el fin de acentuar una estructura. * Enjuague con agua del grifo. Enjuague en agua de carbonato de litio, diluido 1:5 en solución saturada de 1 minuto *. Enjuague con agua del grifo durante 5 minutos *. Las diapositivas son deshidratados en etanol clasificado y las diapositivas se coverslipped (PERTEX, Histolab) Todos los reactivos se aplican a un volumen de 300 l por diapositiva. * Los pasos 10-14 se realizan en un instrumento histostaining (Autostainer XL, Leica) y cubreobjetos es, además, realizar en un sistema cubreportas (cubreportas automatizada CV5030, Leica). 6. Cómo escanearuna diapositiva El método de escanear diapositivas depende del escáner digital que se utilizan, este protocolo sólo define cómo escanear una diapositiva con el análisis del sistema automatizado de Aperio XT (Aperio Technologies). En la proteína humana Atlas configuración 20 aumentos para el tejido y 40x para las células se utilizan. Exploración automatizados podrían encontrar problemas de foco debido a la heterogeneidad del tejido y el número de tejidos diferentes incluidos en un TMA. Limpiar el portaobjetos de vidrio de la suciedad, pegamento y comprobar si las burbujas de aire entre el cubreobjetos y la sección. En caso de que el aire vuelva a montar las burbujas de la diapositiva. Coloque la diapositiva en un bastidor y coloque el estante en el escáner digital. El tiempo para escanear un TMA a 20x de aumento es de aproximadamente 6 minutos. Un software de Aperio se utiliza para seleccionar el área de interés. La selección del punto de enfoque se realiza automáticamente en el software. Manualmente la selección del área de exploración y los puntos focales es también posible. Después de la imagen hcomo se ha generado se puede utilizar para la evaluación y la anotación de la tinción IHC. Las imágenes permanecen como un archivo de resultado del experimento y se puede distribuir a sus colegas para los debates y más utilizado para la publicación de los datos. Las imágenes se pueden ver en un software de libre disposición de Aperio. 7. Cómo buscar tu proteína favorita en el Atlas de proteínas humanas Vaya a www.proteinatlas.org. Introduzca el nombre de su proteína favorita, Ensembl Identificación, número de UniProt adhesión o la insulina HGNC por ejemplo el nombre. Ingresar a la página de resumen y desplácese hacia abajo para el tejido normal y el resumen de órganos. El panorama general muestra la expresión de proteínas en el páncreas. Haga clic en "datos de los tejidos más". Usted entra a los tejidos normales de ver donde se puede ver todos los tejidos incluidos ordenados por órgano. Haga clic en el páncreas para ver los resultados de IHC 3 anticuerpos dirigidos hacia la misma proteína. Para ver una altagh-resolución de imagen de páncreas clic en la imagen. Información adicional acerca de la expresión de proteínas en el tejido canceroso, células y otros datos de validación en el Atlas de proteínas humanas se pueden encontrar navegando por la web Human Protein Atlas. 8. Los resultados representativos Animación 1. ¿Cómo preparar los tejidos para la producción de microarrays de tejidos. Haga clic aquí para ver la Animación 1 . Animación 2. Cómo TMA sección. Haga clic aquí para ver la animación 2 . 3 Animación. La técnica de inmunohistoquímica se describe. Haga clic aquí para ver la animación 3 . Figura 1. Esquema general del proceso dentro de la proteína humana Atlas de Uppsala. Figura 2. Estilete de donantes marcada para la duración estandarizada de los núcleos de tejido, por ejemplo, 4,5 mm. Figura 3. Microarrayer tejido manual. Figura 4. Ejemplos de diferente calidad de las TMA producidos. (A) Una. Recta y alineada correctamente TMA con espacio suficiente entre las filas y columnas, así como a la orilla de la parafina (B) Un TMA con algunos de los núcleos demasiado cerca del borde resultante en dificultades probables cuando seccionamiento. (C) Un TMA que han sido horneados para too largo que resulta en una colapsada TMA sin la plantilla correcta. Figura 5. Hematoxilina y eosina tiñen las TMA. (A) Una sección adecuadamente cortado con columnas rectas y alineados e hileras. Utilizando una cuchilla malo o sucio puede resultar en la división (B) o secciones comprimido (C). Figura 6. La titulación de anticuerpos. (A) Reacción de las células de los ganglios linfáticos en el centro muestra un anticuerpo de forma óptima valora que resulta en una tinción citoplásmica específica (en marrón) sin fondo. (B) La sección de tejido muestra una tinción débil. Tinción negativa o débil se encuentra cuando la concentración de anticuerpo primario es demasiado baja o si la proteína diana no está presente en los tejidos immunostained. (C) La sección de tejido se overstained debido al uso de una concentración demasiado elevada de anticuerpo primario. El darca resultados de color en las dificultades que determinan la localización subcelular, debido a extenderse, la reactividad cruzada y falsos positivos.