Una unidad motora funcional en la placa de cultivo: Co-cultivo de explantes de la médula espinal y las células musculares
Summary
Las células cultivadas del músculo son un modelo inadecuado para recapitular músculo inervado<em> En vivo</em>. Una unidad motora funcional puede ser reproducida<em> In vitro</em> Por la inervación de las células humanas diferenciadas musculares primarias, utilizando explantes de embriones de rata de la médula espinal. En este artículo se describe cómo co-cultivos de explantes de la médula espinal y las células musculares se han establecido.
Abstract
Las células musculares primarias cultivaron en monocapa aneurally raramente contraen espontáneamente porque, en ausencia de un componente de nervio, la diferenciación celular y el motor se limita la estimulación de neuronas que falta 1. Estas limitaciones dificultan el estudio in vitro en el de muchas enfermedades neuromusculares en las células musculares cultivadas. Es importante destacar que las limitaciones experimentales de células monocapa, músculo cultivadas pueden ser superados por la inervación funcional de miofibras con explantes de médula espinal en co-cultivos.
Aquí, se muestran los diferentes pasos necesarios para lograr una inervación eficiente, adecuada de las células musculares primarios, que conduce a completar la diferenciación y la contracción de fibra de acuerdo con el método desarrollado por Askanas 2. Para ello, las células musculares son co-cultivadas con explantes de la médula espinal de embriones de rata en el ED 13,5, con los ganglios de la raíz dorsal todavía unido a las rebanadas de la médula espinal. Después de unos días, el músculo fibros comenzará a contraerse y, eventualmente, convertirse en la cruz-estriado a través de inervación por neuritas funcionales que se proyectan desde los explantes de la médula espinal que se conectan a las células musculares. Esta estructura puede mantenerse durante muchos meses, simplemente por intercambio regular del medio de cultivo.
Las aplicaciones de esta herramienta de valor incalculable son numerosas, ya que representa un modelo funcional para realizar análisis multidisciplinarios de desarrollo de los músculos humanos y la inervación. De hecho, una completa instalación de novo unión neuromuscular se produce en un plato de cultivo, permitiendo una fácil medición de muchos parámetros en cada paso, en un contexto fundamental y fisiológicas.
Sólo para citar algunos ejemplos, genómica y / o estudios de proteómica se puede realizar directamente en la co-culturas. Además, los efectos de pre y post-sináptica puede ser específica y se evaluó por separado en la unión neuromuscular, debido a que ambos componentes provienen de diferentes especies,rata y humano, respectivamente. El nervio-músculo co-cultivo también puede realizarse con células musculares humanas aisladas de pacientes que sufren de enfermedades neuromusculares músculo o 3, y por lo tanto puede ser utilizado como una herramienta de detección para los fármacos candidatos. Finalmente, ningún equipo especial, pero una instalación normal BSL2 se necesita para reproducir una unidad de motor funcional en una placa de cultivo. Este método, por lo que es valioso tanto para el músculo, así como las comunidades de investigación neuromusculares para estudios fisiológicos y mecanicista de la función neuromuscular, en un contexto normal y la enfermedad.
Protocol
Discussion
Una herramienta fisiológica in vitro para estudiar la función de las células musculares en el contexto normal y lo patológico es de mayor interés para los myologists, debido a cultivos de células musculares no suelen recapitular la importancia de las células y las conexiones múltiples de tipo celular. La adición de las neuronas motoras purificadas a las células musculares no es suficiente para lograr una unidad de motor funcional ya que la presencia de células de Schwann se requiere para la inervaci?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nuestro trabajo es apoyado por la Swiss National Science Foundation (SNF), la Iniciativa de Suiza en Biología de Sistemas (SystemsX.ch), la Asociación de Distrofia Muscular EE.UU. (MDA), la Asociación Francesa contra las Miopatías (AFM), la United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF), la Fundación Gebert-Ruf Enfermedades Raras Programa (GRF), la Sociedad Suiza para la Investigación de las Enfermedades Musculares (SSEM / FSRMM), el Swiss Life "Jubiläumsstiftung für Medizinische Forschung und Volksgesundheit", la Roche Fundación para la Investigación y la Universidad de Basilea.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog Number |
| HBSS | Gibco/Invitrogen | 14170 |
| MEM | Gibco/Invitrogen | 31095 |
| Medium 199 | Gibco/Invitrogen | 31153 |
| Fetal Bovine Serum | Fetal Clone Perbio | SH30066.03 |
| Insuline | Sigma | I9278 |
| Human EGF | Sigma | E9644 |
| Human FGF | Sigma | F0291 |
| Penicillin/streptomycin solution | Gibco | 15140 |
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