Summary

Функциональный блок двигателя в культуре блюдо: Co-культуре эксплантов спинного мозга и мышечных клеток

Published: April 12, 2012
doi:

Summary

Искусственный клеток являются недостаточными модель повторять иннервируемых мышц<em> В естественных условиях</em>. Функциональный блок двигателя может быть воспроизведена<em> В пробирке</em> По иннервации дифференцированных человеческих первичных клеток эмбриона крысы использование эксплантов спинного мозга. Эта статья описывает, как со-культур спинного мозга и эксплантов мышечных клетках установлены.

Abstract

Человека первичных клеток культивировали в монослое aneurally редко контракт спонтанно, потому что, при отсутствии нервного компонента клеточной дифференцировки ограничены и двигательных нейронов возбуждение отсутствует 1. Эти ограничения препятствуют в пробирке исследования многих нервно-мышечных заболеваний в культуре клеток. Важно отметить, что экспериментальные ограничения monolayered, культивируемых клетках мышц может быть преодолен функциональный иннервации мышечных волокон с спинного мозга в эксплантов со-культур.

Здесь мы покажем, различные шаги, необходимые для достижения эффективных, надлежащих иннервации человека первичных клеток, приводит к полной дифференциации и сокращения волокна в соответствии с методом, разработанным Askanas 2. Для этого, мышечные клетки культивировали совместно со спинальной эксплантов шнур эмбрионов крыс на ED 13.5, со спинной ганглий корень все еще прикреплены к спинной кусочки мозга. Через несколько дней, мышцы FiБерс начать сокращаться и в конечном итоге стать поперечно-полосатой через иннервации функциональной невриты, выступающую из спинного мозга, что эксплантаты подключения к мышечным клеткам. Эта структура может сохраняться в течение многих месяцев, просто регулярный обмен питательной среде.

Применение этого бесценного инструмента являются многочисленными, как он представляет собой функциональную модель междисциплинарного анализа человеческого развития мышц и иннервации. На самом деле, полное заново нервно-мышечного соединения установка происходит в культуре блюдо, позволяющий легко определить многие параметры на каждом шагу, в фундаментальные и физиологические контексте.

Просто приведу несколько примеров, геномных и / или протеомных исследований могут быть выполнены непосредственно на со-культур. Кроме того, в пред-и пост-синаптические эффекты могут быть специально и отдельно оценивается в нервно-мышечном соединении, так как компоненты из разных видов,крысы и человека, соответственно. Нервно-мышечного со-культуры могут быть выполнены с человеческими клетками, выделенных от больных страдают от мышечной или нервно-мышечными заболеваниями 3, и таким образом может быть использован в качестве инструмента отбора кандидатов для лекарств. Наконец, ни специального оборудования, но регулярно BSL2 объект, необходимых для воспроизведения функциональных двигательных единиц в культуре блюдо. Этот метод так ценен как для мышц, а также нервно-мышечных общин исследования физиологических и механических исследований нервно-мышечных функций, в нормальные и заболевание контексте.

Protocol

1. Подготовка первичной человеческой культуры мышечных клеток Установить культуре человеческих клеток мышц в соответствии с эксплантации-ре-эксплантации техника 4. Во-первых, удалите не-мышечной ткани биопсии. Затем вставлять 1 мм 3 эксплантатах мышцы в сгусток плазмы…

Discussion

Физиологические в пробирке инструментом для изучения функции мышечных клеток в норме и патологии контексте наибольший интерес для myologists, потому что культуру мышечных клеток, как правило, не повторять о важности нескольких ячеек и типа соединения. Кроме очищенной моторных нейрон?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Наша работа при поддержке Швейцарского национального научного фонда (ОЯТ), швейцарская инициатива в системной биологии (SystemsX.ch), мышечная дистрофия ассоциации США (MDA), Ассоциация Française контр-ле-Миопатии (АСМ), Соединенные митохондриальной болезни фонда (UMDF), Геберт-ОРФ Фонд редких болезней программы (ГРФ), Швейцарского общества исследований мышечных заболеваний (SSEM / FSRMM), Swiss Life "Jubiläumsstiftung für Volksgesundheit унд медицинских исследований", Roche Фонд исследований и университета Базель.

Materials

Name of reagent Company Catalog Number
HBSS Gibco/Invitrogen 14170
MEM Gibco/Invitrogen 31095
Medium 199 Gibco/Invitrogen 31153
Fetal Bovine Serum Fetal Clone Perbio SH30066.03
Insuline Sigma I9278
Human EGF Sigma E9644
Human FGF Sigma F0291
Penicillin/streptomycin solution Gibco 15140

Referências

  1. Delaporte, C., Dautreaux, B., Fardeau, M. Human myotube differentiation in vitro in different culture conditions. Biol. Cell. 57, 17-22 (1986).
  2. Kobayashi, T., Askanas, V., Engel, W. K. Human muscle cultured in monolayer and cocultured with fetal rat spinal cord: importance of dorsal root ganglia for achieving successful functional innervation. J. Neurosci. 7, 3131-3141 (1987).
  3. Braun, S., Croizat, B., Lagrange, M. C., Warter, J. M., Poindron, P. Constitutive muscular abnormalities in culture in spinal muscular atrophy. Lancet. 345, 694-695 (1995).
  4. Askanas, V., Engel, W. K. A new program for investigating adult human skeletal muscle grown aneurally in tissue culture. Neurology. 25, 58-67 (1975).
  5. Guettier-Sigrist, S., Coupin, G., Warter, J. M., Poindron, P. Cell types required to efficiently innervate human muscle cells in vitro. Exp. Cell Res. 259, 204-212 (2000).
  6. Lefebvre, S. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell. 80, 155-165 (1995).
  7. Schrank, B. Inactivation of the survival motor neuron gene, a candidate gene for human spinal muscular atrophy, leads to massive cell death in early mouse embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 9920-9925 (1997).
  8. Hsieh-Li, H. M. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24, 66-70 (2000).
  9. Monani, U. R. The human centromeric survival motor neuron gene (SMN2) rescues embryonic lethality in Smn(-/-) mice and results in a mouse with spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 9, 333-339 (2000).
  10. Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Dis. Model. Mech. 4, 457-467 (2011).
  11. Durbeej, M., Campbell, K. P. Muscular dystrophies involving the dystrophin-glycoprotein complex: an overview of current mouse models. 12, 349-361 (2002).
  12. Schnabel, J. Neuroscience: Standard model. Nature. 454, 682-685 (2008).
  13. Benatar, M. Lost in translation: treatment trials in the SOD1 mouse and in human ALS. Neurobiol. Dis. 26, 1-13 (2007).
  14. Dorchies, O. M. Normal innervation and differentiation of X-linked myotubular myopathy muscle cells in a nerve-muscle coculture system. Neuromuscul. Disord. 11, 736-746 (2001).
  15. McFerrin, J., Engel, W. K., Askanas, V. Impaired innervation of cultured human muscle overexpressing betaAPP experimentally and genetically: relevance to inclusion-body myopathies. Neuroreport. 9, 3201-3205 (1998).
check_url/pt/3616?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Arnold, A., Christe, M., Handschin, C. A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells. J. Vis. Exp. (62), e3616, doi:10.3791/3616 (2012).

View Video