יחידת מנוע פונקציונלית בצלחת תרבות: עמית תרבות Explants חוט השדרה לתאי השריר
Summary
בתאי שריר בתרבית הם מודל לקוי לשחזר שרירים מעוצבבים<em> In vivo</em>. יחידת המנוע תפקודית ניתן לשחזר<em> במבחנה</em> על ידי עצבוב של האדם תאים הבדיל השריר העיקרי העובר באמצעות חולדה explants חוט השדרה. מאמר זה מתאר כיצד שיתוף תרבויות explants בעמוד השדרה ותאי שריר מבוססים.
Abstract
אדם לתאי שריר ראשוניים בתרבית aneurally בשכבה כמעט באופן ספונטני, כי החוזה, בהעדר מרכיב העצב, התמיינות תאים מוגבל גירוי נוירון מוטורי חסר 1. מגבלות אלה לעכב את המחקר במבחנה ב neuromuscular של מחלות רבות בתאי שריר בתרבית. חשוב לציין, מגבלות הניסוי של תאים בתרבית monolayered שרירים ניתן להתגבר על ידי עצבוב התפקודי של myofibers עם explants בעמוד השדרה של שיתוף תרבויות.
כאן, אנו מציגים את השלבים השונים הנדרשים על מנת להשיג העצבוב יעיל, תקין של אדם לתאי שריר ראשוניים, המוביל להשלים את התכווצות בידול וסיבים לפי השיטה שפותחה על ידי Askanas 2. כדי לעשות זאת, תא שריר שיתוף תרבותי עם explants בעמוד השדרה של עוברי עכברים בבית ED 13.5, עם הגרעינים השורש הגבי מחוברת עדיין את פרוסות בעמוד השדרה. אחרי כמה ימים, שרירים Fibers להתחיל להתכווץ בסופו של דבר בין מפוספס דרך העצבוב על ידי neurites תפקודית מקרין מן explants בעמוד השדרה כי בהתחברות לתאי השריר. מבנה זה יכול להישמר במשך חודשים רבים, פשוט על ידי דיאלוג על בסיס קבוע בינוני התרבות.
יישומים של כלי זה הן רבות שלא יסולא בפז, שכן היא מייצגת מודל פונקציונלי ניתוח רב תחומי של פיתוח שרירים העצבוב האדם. למעשה, שלמה דה נובו ההתקנה צומת neuromuscular מתרחשת בצלחת התרבות, המאפשר מדידה קלה של פרמטרים רבים בכל שלב, בהקשר יסודי פיזיולוגית.
רק כדי להזכיר כמה דוגמאות, גנומית ו / או מחקרים proteomic יכול להתבצע ישירות על שיתוף תרבויות. יתר על כן, תופעות לפני ואחרי סינפטי ניתן להעריך במיוחד ובנפרד בצומת neuromuscular, כי שני הרכיבים מגיעים מינים שונים,עכברוש האדם, בהתאמה. עצב, שריר שיתוף תרבות יכולה גם להתבצע עם אדם לתאי שריר מבודד לחולים הסובלים ממחלות שריר או neuromuscular 3, ולכן יכול לשמש ככלי מיון עבור תרופות המועמד. לבסוף, ציוד מיוחד, אך לא מתקן קבוע BSL2 צורך לשחזר יחידה תפקודית מוטורית בצלחת התרבות. שיטה זו ולכן הוא בעל ערך שריר הן, כמו גם בקהילות מחקר neuromuscular ללימודי פיזיולוגיות מכניסטית של הפונקציה neuromuscular, בהקשר הרגיל ומחלות.
Protocol
Discussion
כלי במבחנה פיזיולוגי ללמוד התא תפקוד השרירים בהקשר רגיל וגם בזמן מחלה מעניין הגבוה ביותר myologists, כי התא תרבויות שרירים בדרך כלל לא לשחזר את החשיבות של מספר תאים ותא מסוג חיבורים. תוספת של מטוהרים הנוירונים המוטוריים לתאי השריר אינה מספיקה כדי להשיג את יחידת המנו?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה שלנו נתמך על ידי השוויצרי הקרן הלאומית למדע (SNF), יוזמת שווייץ Systems Biology (SystemsX.ch), ניוון שרירים האגודה ארה"ב (MDA), את Francaise האגודה contre לס Myopathies (AFM), מיטוכונדריאלי הברית מחלות קרן (UMDF), Gebert-רוף קרן תכנית מחלות נדירות (פוי), החברה השוויצרית למחקר של מחלות שריר (SSEM / FSRMM), החיים השוויצרי "Jubiläumsstiftung für und Volksgesundheit medizinische Forschung", מחקר רוש קרן האוניברסיטה באזל.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog Number |
| HBSS | Gibco/Invitrogen | 14170 |
| MEM | Gibco/Invitrogen | 31095 |
| Medium 199 | Gibco/Invitrogen | 31153 |
| Fetal Bovine Serum | Fetal Clone Perbio | SH30066.03 |
| Insuline | Sigma | I9278 |
| Human EGF | Sigma | E9644 |
| Human FGF | Sigma | F0291 |
| Penicillin/streptomycin solution | Gibco | 15140 |
Referências
- Delaporte, C., Dautreaux, B., Fardeau, M. Human myotube differentiation in vitro in different culture conditions. Biol. Cell. 57, 17-22 (1986).
- Kobayashi, T., Askanas, V., Engel, W. K. Human muscle cultured in monolayer and cocultured with fetal rat spinal cord: importance of dorsal root ganglia for achieving successful functional innervation. J. Neurosci. 7, 3131-3141 (1987).
- Braun, S., Croizat, B., Lagrange, M. C., Warter, J. M., Poindron, P. Constitutive muscular abnormalities in culture in spinal muscular atrophy. Lancet. 345, 694-695 (1995).
- Askanas, V., Engel, W. K. A new program for investigating adult human skeletal muscle grown aneurally in tissue culture. Neurology. 25, 58-67 (1975).
- Guettier-Sigrist, S., Coupin, G., Warter, J. M., Poindron, P. Cell types required to efficiently innervate human muscle cells in vitro. Exp. Cell Res. 259, 204-212 (2000).
- Lefebvre, S. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell. 80, 155-165 (1995).
- Schrank, B. Inactivation of the survival motor neuron gene, a candidate gene for human spinal muscular atrophy, leads to massive cell death in early mouse embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 9920-9925 (1997).
- Hsieh-Li, H. M. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24, 66-70 (2000).
- Monani, U. R. The human centromeric survival motor neuron gene (SMN2) rescues embryonic lethality in Smn(-/-) mice and results in a mouse with spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 9, 333-339 (2000).
- Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Dis. Model. Mech. 4, 457-467 (2011).
- Durbeej, M., Campbell, K. P. Muscular dystrophies involving the dystrophin-glycoprotein complex: an overview of current mouse models. 12, 349-361 (2002).
- Schnabel, J. Neuroscience: Standard model. Nature. 454, 682-685 (2008).
- Benatar, M. Lost in translation: treatment trials in the SOD1 mouse and in human ALS. Neurobiol. Dis. 26, 1-13 (2007).
- Dorchies, O. M. Normal innervation and differentiation of X-linked myotubular myopathy muscle cells in a nerve-muscle coculture system. Neuromuscul. Disord. 11, 736-746 (2001).
- McFerrin, J., Engel, W. K., Askanas, V. Impaired innervation of cultured human muscle overexpressing betaAPP experimentally and genetically: relevance to inclusion-body myopathies. Neuroreport. 9, 3201-3205 (1998).
