ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים
Summary
שיטה א 'תנאי מציאה ביטוי חלבון המטרה ברשתית דג הזברה מבוגר מתואר, הכוללת הזרקת intravitreally morpholinos antisense ו electroporating אותם לתוך הרשתית. החלבון המתקבל הוא הפיל במשך כמה ימים, אשר מאפשר בדיקת תפקידו של החלבון או התחדשות הרשתית ללא פגע.
Abstract
רבים מחלות עיניים תורשתיות הרסנית לגרום לעיוורון מתקדם ובלתי הפיך, משום שבני אדם לא יכולים להתחדש גוסס או חולה הנוירונים ברשתית. לעומת זאת, דג הזברה הרשתית מבוגר בעל יכולת חזקים כדי להתחדש באופן ספונטני כל הכיתה עצבי הולך לאיבוד במגוון רחב של דגמים שונים לנזק ברשתית, כולל לנקב רשתית, אבלציה כימית, חום גבוה ומרוכז, וטיפול אור חזק 1-8. המעבדה שלנו מאופיין בהרחבה התחדשות של photoreceptors בעקבות טיפול קבוע אור עז נוירונים ברשתית הפנימי לאחר intravitreal ouabain זריקה 2, 5, 9. בכל המקרים, תושב גליה מולר להזין מחדש את מחזור התא לייצר אבות העצבית, אשר ממשיכים להתרבות ולהעביר את שכבת הרשתית תקין, שבו הם להתמיין הנוירונים לקוי.
אנו מאופיינים חמישה שלבים שונים במהלך רגנרציה של אור Damaהרשתית GED שהיו מודגשת על ידי התגובות הסלולר ספציפיים. זיהינו מספר גנים הביע דיפרנציאלי בכל שלב של התחדשות רשתית על ידי ניתוח ה-mRNA microarray 10. רבים מן הגנים האלה הם גם קריטי להתפתחות העין. כדי לבדוק את תפקידו של גן כל מועמד / חלבון במהלך רגנרציה רשתית, עלינו לפתח שיטה תנאי להגביל את הביטוי של החלבון מועמד רק בזמנים במהלך רגנרציה של הרשתית מבוגר.
Oligos Morpholino נמצאים בשימוש נרחב ללמוד אובדן תפקוד של חלבונים ספציפיים במהלך הפיתוח של דג הזברה, Xenopus, אפרוח, עכבר, וגידולים xenografts אנושי 11-14. אלה basepair שונה oligos עם רצף RNA משלים או לחסום את שחבור או התרגום של רנ"א היעד. Morpholinos יציבים בתא והוא יכול לחסל או "מציאה" חלבון ביטוי במשך שלושה עד חמישה ימים 12.
כאן,אנו מתארים שיטה יעילה ביטוי חלבון מטרה מציאה ברשתית דג הזברה מבוגר. שיטה זו מעסיקה lissamine-tagged morpholinos antisense כי הם שהוחדר לתוך הזגוגית של העין דג הזברה מבוגר. בעזרת מלקחיים אלקטרודה, morpholino הוא electroporated מכן לתוך כל סוגי התאים של הרשתית הגב מרכזי. Lissamine מספק את האחראי על morpholino עבור electroporation וניתן דמיינו להעריך את הנוכחות של morpholino בתאי הרשתית.
מציאה מותנה ברשתית יכול לשמש כדי לבחון את התפקיד של חלבונים מסוימים בזמנים שונים במהלך רגנרציה. בנוסף, גישה זו ניתן להשתמש כדי ללמוד את התפקיד של חלבונים ספציפיים ברשתית ניזוק, בתהליכים כגון התמרה חזותית עיבוד חזותי נוירונים מסדר שני.
Protocol
Discussion
לאחרונה, שני ניתוחים microarray בדקו את ביטוי הגנים השינויים שחלו במהלך רגנרציה של הרשתית או אור פגום או תיקון רשתית בניתוח נכרת 10, 16. שני המחקרים גילה גנים רבים אשר הציג שינויים משמעותיים הביטוי, או להגדיל או להקטין, כי סביר נדרשים עבור אירועים שונים המתרחשים במהלך התחדשות הרשתית, כגון כניסה מחדש של גליה מולר לתוך מחזור התא, המשך התפשטות והגירה של אבות העצבית על השכבה הרשתית פגום, ואת הבידול של אבות העצבית לסוג התא לתקן את עצבי. אמנם השוואה ישירה של שתי קבוצות microarray נתונים לגלות גנים מועמדים שעשויים להיות מעורבים האירועים הללו הסלולר, בסופו של דבר הגנים הללו החלבונים המקודדים שלהם חייבים להיבדק כדי לקבוע אם הם נחוצים התחדשות הנוירונים. כאן, אנו מתארים גישה חזקה אובדן-of-פונקציה conditionally מציאה חלבונים עניין ברשתית דג הזברה מבוגר. טכניקה זו שימשה ללמוד שני חלבונים תאיים ו תאיים, וכן מולקולות איתות, גורמי שעתוק וחלבונים הדרושים שכפול הדנ"א 17-19. לכן, שיטה זו סייעה רבות להבנת המנגנון המולקולרי שבבסיס התחדשות הרשתית הבוגרת דג הזברה.
בדקנו פרמטרים electroporation מרובים (, מתח מספר פולסים, זמן בין הפולסים), לפני פרוטוקול מוצלח הושג. בדו"ח הקודם של electroporating morpholinos לתוך סנפיר הזנב דג הזברה התחדשות בשימוש 10 פולסים במתח נמוך (15 V) 20. מכיוון הרשתית דג הזברה מבוגר מוקף שכבות תאים מרובים אינו נגיש בקלות אלקטרודות פינצטה, הפרמטרים המשמשים סנפיר צלחו בשעה ביעילות electroporating morpholinos לתוך הרשתית מבוגר. לעומת זאת, מתח גבוה (100 V) לעיתים קרובות מילulted מוות לדגים. לאחרונה, 5 פולסים של 80 V תוארה electroporate פלסמיד דנ"א לתוך הרשתית עכבר שזה עתה נולד גור 21. מצאנו כי מעט פחות אינטנסיבי 2 פעימות של 75 הביא V ב electroporation מוצלח של morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה מבוגרים עם הישרדות של 100% מהדגים טופלו. בנוסף, גילינו כי הסרת החיצונית ביותר (או החיצונית ביותר) מרכיב של הקרנית בצורה ניכרת את יעילות electroporation. הגדלת מספר פעימות עשוי לבטל את הצורך הסרה של רקמה זו, אך עלולים גם הם לגרום נזק לרקמות גדולה יותר. מחקרים מקיפים הראו כי שליטה בפרמטרים הללו לא גרמו למוות משמעותי כל תא ברשתית או לשנות את התגובות הסלולר ספציפיים שנצפה במהלך photoreceptor התחדשות 19. Gain-of-לתפקד בלימודים אינם אפשריים כיום באמצעות טכניקה זו in vivo, בשל חוסר היכולת שלנו באופן עקבי electroporate חומצות ריבונוקלאית גדול לתוך כל retinal תאים. עם זאת, ההצלחה של electroporating פלסמידים לתוך הרשתית עכבר in vivo ו הרשתית דג הזברה ב explants מציע זה עדיין אפשרות של דג הזברה 21, 22.
אחד היתרונות של טכניקה זו היא electroporation נראה ביעילות להציג את morpholino לתוך כל סוגי תאים ברשתית. עם זאת, חולשה פוטנציאלית היה electroporation ביעילות סיפק את morpholino לתוך רק באזורים ברשתית הגב מרכזי. אירוע electroporation second לקראת המחצית הגחון של תוצאות הרשתית בשנת מיקוד טוב כל השכבות, אבל לעתים קרובות גורם לנזק. זו מגבלה מרחבית סביר נבעה הצורה והמיקום של האלקטרודות. השימוש אישית מעוצבת בצורת כוס אלקטרודות שניתן להציב סביב העין עשוי לשפר את החולשה הזאת. זו מגבלה המרחבי של מסירת morpholino מגביל את השימוש בטכניקה זו מונע את השימוש של suc assayh כמו ניתוח ERG כי ידרוש הערכה גלובלית של הרשתית. יצוין כי כמו כל ניסוי morpholino, רצוי לאשר את התוצאות באמצעות שנייה, שאינן חופפות morpholino ל-mRNA היעד. במקרים מסוימים, ניתן גם electroporate two morpholinos שונים בו זמנית מציאה את הביטוי של שני חלבונים שונים. הראינו את זה על ידי דריסה ביטוי הן את Pax6a וחלבונים Pax6b, בנפרד או ביחד 18.
למרות שאנו הדגימו את השימוש בטכניקה זו עם מודל נזק האור שלנו, זה יכול להיות בשימוש סביר ללמוד התחדשות במודלים של נזק אחר 2-8 או להשתמש כדי לבחון את תפקודם של חלבונים פגומים ברשתית. לדוגמה, electroporation של morpholinos יכול לשמש מציאה הביטוי של ערוצים ספציפיים או התמרה מולקולות איתות בתוך הגנגליון או תאים amacrine ולאחר מכן ללמוד את הפונקציה של אותות אלההמסלולים בעיבוד חזותי. עם זאת, כפי morpholinos רק להשפיע על התרגום של חלבון חדש, אפשר היה לחכות עד מחזור חלבון אנדוגני מתרחשת לפני assay ניתן לבצעו. תלוי ביציבות של החלבון, שיכול לנוע בין 18 שעות עד ימים.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות מדעי החיים פריימן מרכז מרכז צוות מחקר דג הזברה לטיפול שלהם ותחזוקה של דג הזברה.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator | Protech International | CUY21EDIT or CUY21SC | Both units work for this protocol |
| 3-mm diameter paddle electrodes | Protech International | CUY 650-P3 | |
| Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
| 2-Phenoxyethanol | Sigma | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
| Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments | 14095 | Any #5 tweezers with work |
| Dumont #5B tweezers with angled tips | World Precision Instruments | 500234 | Used to enucleate eye following euthanasia |
| Sapphire blade, double edge lance, 1 mm wide, with Sapphire knife handle | World Precision Instruments | Blade: 500314 Handle: 500317 |
|
| Hamilton syringe with removable 33 gauge blunt-end needle | Hamilton company | Syringe: 87930 Needle: 7762-06 |
Remove needle that comes with syringe and replace with 33-gauge blunt-end needle |
Referências
- Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration. J. Neurosci. 28, 1109-1117 (2008).
- Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. Regeneration of inner retinal neurons after intravitreal injection of ouabain in zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).
- Hitchcock, P., Ochocinska, M., Sieh, A., Otteson, D. Persistent and injury-induced neurogenesis in the vertebrate retina. Prog. Retin. Eye Res. 23, 183-194 (2004).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. B.M.C Dev. Biol. 6, 36-36 (2006).
- Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J. Neurobiol. 44, 289-307 (2000).
- Wolburg, H. Time- and dose-dependent influence of ouabain on the ultrastructure of optic neurones. Cell Tissue Res. 164, 503-517 (1975).
- Wu, D. M., Schneiderman, T., Burgett, J., Gokhale, P., Barthel, L., Raymond, P. A. Cones regenerate from retinal stem cells sequestered in the inner nuclear layer of adult goldfish retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42, 2115-2124 (2001).
- Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Muller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
- Vihtelic, T. S., Soverly, J. E., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Retinal regional differences in photoreceptor cell death and regeneration in light-lesioned albino zebrafish. Exp. Eye Res. 82, 558-575 (2006).
- Kassen, S. C., Ramanan, V., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Liu, C. G., Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev. Neurobiol. 67, 1009-1031 (2007).
- Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Dev. Biol. 222, 124-134 (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation. Genesis. 30, 198-200 (2001).
- London, C. A., Sekhon, H. S., Arora, V., Stein, D. A., Iversen, P. L., Devi, G. R. A novel antisense inhibitor of MMP-9 attenuates angiogenesis, human prostate cancer cell invasion and tumorigenicity. Cancer Gene Ther. 10, 823-832 (2003).
- Thummel, R., Kassen, S. C., Enright, J. M., Nelson, C. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. Characterization of Muller glia and neuronal progenitors during adult zebrafish retinal regeneration. Exp. Eye Res. 87, 433-444 (2008).
- Cameron, D. A., Gentile, K. L., Middleton, F. A., Yurco, P. Gene expression profiles of intact and regenerating zebrafish retina. Mol. Vis. 11, 775-791 (2005).
- Craig, S. E., Thummel, R., Ahmed, H., Vasta, G. R., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 3244-3252 (2010).
- Thummel, R., Enright, J. M., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Bailey, T. J., Hyde, D. R. Pax6a and Pax6b are required at different points in neuronal progenitor cell proliferation during zebrafish photoreceptor regeneration. Exp. Eye Res. 90, 572-582 (2010).
- Thummel, R., Kassen, S. C., Montgomery, J. E., Enright, J. M., Hyde, D. R. Inhibition of Muller glial cell division blocks regeneration of the light-damaged zebrafish retina. Dev. Neurobiol. 68, 392-408 (2008).
- Thummel, R., Bai, S., Sarras, M. P., Song, P., McDermott, J., Brewer, J., Perry, M., Zhang, X., Hyde, D. R., Godwin, A. R. Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb. Dev. Dyn. 235, 336-346 (2006).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 101, 16-22 (2004).
- Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina. Cell Tissue Res. 332, 195-209 (2008).
