Disseksjon og kultur av Chick Statoacoustic ganglion og Spinal Cord explants i Collagen Gels for neurite utvekst Assays
Summary
Vi viser hvordan å dissekere og kultur chick E4 statoacoustic ganglion og E6 ryggmargen explants. Explants dyrkes i henhold til serum-frie forhold i 3D kollagen gels i 24 timer. Neurite respons er testet med vekstfaktor-supplert medium og med protein-belagt perler.
Abstract
Den sensoriske organer kylling indre øret er innerverte av perifere prosesser statoacoustic ganglion (SAG) nerveceller. Sensoriske organ innervasjon er avhengig av en kombinasjon av axon veiledning pekepinner 1 og overlevelse faktorer 2 ligger langs banen voksende axoner og / eller innenfor de sensoriske organ mål. For eksempel generert funksjonelle forstyrrelser med en klassisk axon veiledning signalveien, semaphorin-neuropilin, misrouting av otic axons 3. Også flere vekstfaktorer uttrykt i sensoriske mål i det indre øret, inkludert Neurotrophin-3 (NT-3) og Brain Avledet neurotrophic Factor (BDNF), har blitt manipulert i transgene dyr, igjen fører til misrouting av SAG axons fire. De samme molekylene fremme både overlevelse og neurite utvekst av chick SAG nerveceller in vitro 5,6.
Her beskriver vi og demonstrere in vitro metode er vi for tiden usynge for å teste responsen til chick SAG neurites til løselige proteiner, inkludert kjente morphogens som Wnts, samt vekstfaktorer som er viktige for å fremme SAG neurite utvekst og neuron overlevelse. Ved hjelp av denne modellen system, håper vi å trekke konklusjoner om effekter som utskilles ligander kan øve på SAG neuron overlevelse og neurite utvekst.
SAG explants er dissekert på embryonale dag 4 (E4) og kultivert i tredimensjonale kollagen gel henhold til serum-frie forhold i 24 timer. Først er neurite respons testet av dyrkning explants med protein-supplert medium. Så, for å spørre om punktkilder av utskilles ligander kan ha retningsbestemt effekter på neurite utvekst, er explants co-kultiverte med protein-belagt perler og analysert for evne til perle til lokalt fremme eller hemme utvekst. Vi inkluderer også en demonstrasjon av disseksjon (modifisert protokoll 7) og kultur av E6 ryggmargen explants. Virutinemessig bruk ryggmargen explants å bekrefte bioaktivitet av proteiner og protein-gjennomvåt perler, og for å verifisere arter kryssreaksjon med kylling vev, under samme kultur vilkår som SAG explants. Disse de vitro er praktisk for raskt screening for molekyler som utøver trofisk (overlevelse) eller tropic (retningsbestemt) effekter på SAG nervecellene, spesielt før du utfører studier in vivo. Videre tillater denne metoden testing av enkelte molekyler i henhold til serum-frie forhold, med høy neuron overlevelse 8.
Protocol
Discussion
Vi presenterer en metode for å dissekere og kultur E4 SAG og E6 ryggmargen explants, fra kylling, under serum-free forhold. Denne prosedyren brukes i dag i vårt laboratorium for å studere effekter av ulike utskilles ligander på SAG neuron overlevelse og neurite utvekst. Novel aspekter av denne protokollen inkluderer bruk av et serum-free system for dyrking explants og bruk av perler dynket i vekstfaktorer for å studere effekter på SAG neurite utvekst. En perle metode som oss har blitt beskrevet for dama ryggmargen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health Grant RO1DC002756 og Purdue Research Foundation. Vi takker Doris Wu og Wiese Chang for råd med eksperimenter og Rodney McPhail for hjelp med figurer.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Comment |
| Equipment |
|
||
| Dissection microscope |
|
We use a Leica M80 stereomicroscope with brightfield base illumination | |
| Slide warmer | C.S. & E. |
Collagen polymerization | |
| Chicken egg incubator |
|
||
| 37°C/5% CO2 humidified cell culture incubator |
|
||
|
|||
| Dissection Materials |
|
||
| Sylgard© coated petri dish |
|
||
| 24-well cell culture plate | Corning |
3526 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools |
11252-30 | |
| #55 Dumont forceps | Fine Science Tools |
11295-51 | |
| Stainless steel dissecting pins | Fine Science Tools |
26002-10 | Embryo pinning, fine dissection |
| Moria perforated spoon | Fine Science Tools |
10370-17 | Embryo harvest/transfer |
| 200 µl wide mouth pipet tips | Dot Scientific Inc |
118-96R | Explant transfer |
|
|||
| E4 and E6 chicken eggs |
|
||
| Chick Ringer’s solution |
|
Embryo harvest | |
| HBSS | Sigma |
H8264 | SAG dissection |
| L15 medium | Sigma |
L5520 | Spinal cord dissection medium |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals |
S11150 | Spinal cord dissection medium |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments |
501778 | Spinal cord dissection |
|
|||
| Collagen preparation |
|
||
| Rat-tail collagen Type I | BD Biosciences |
354249 | Explant culture |
| 10X PBS (Sterile) |
|
To neutralize collagen | |
| 1N NaOH (Sterile) |
|
To neutralize collagen | |
| Distilled water (Sterile) |
|
To neutralize collagen | |
| pH indicator papers (6.0-8.1) | Whatman |
2629-990 | To check collagen pH |
| 15 ml conical tubes | Dot Scientific Inc |
818-PG | |
| 500 µl wide mouth pipet tips | Dot Scientific Inc |
119-R100 | To pipet collagen |
|
|||
| Explant culture |
|
||
| DMEM/F12 medium | Sigma |
D8437 | Explant culture medium |
| ITS+1 | Sigma |
I2521 | Medium supplement |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen |
15140-122 | Medium supplement |
| CNTF (rat) | Sigma |
C3835 | Medium supplement |
| NT-3 (human) | Sigma |
N1905 | Medium supplement |
| Purified mouse Wnt5a | R&D Systems |
645-WN-010 | |
| Affi-gel Blue gel beads | Bio-Rad |
153-7302 | |
|
|||
| Immunohistochemistry |
|
||
| Paraformaldehyde | Sigma |
P6148 | Fixation |
| PBS |
|
Rinses | |
| Triton X-100 | Sigma |
T9284 | Blocking solution |
| Sodium azide | Sigma |
S8032 | Blocking solution |
| Calf serum | Invitrogen |
16170-078 | Blocking solution |
| Mouse monoclonal IgG2b anti-β Tubulin 1+II antibody | Sigma |
T8535 | Labels cell bodies and neurites |
| Alexa fluor 488 goat anti –mouse IgG2b antibody | Invitrogen |
A21141 | Detects β Tubulin antibody |
| Teflon micro spatula | VWR |
57949-033 | Release collagen gels from well |
Referências
- Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 549-549 (2007).
- Fritzsch, B. Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia. Brain Res. Bull. 60 (5-6), 423-423 (2003).
- Gu, C. Neuropilin-1 conveys semaphorin and VEGF signaling during neural and cardiovascular development. Dev. Cell. 5 (1), 45-45 (2003).
- Tessarollo, L., Coppola, V., Fritzsch, B. NT-3 replacement with brain-derived neurotrophic factor redirects vestibular nerve fibers to the cochlea. J. Neurosci. 24 (10), 2575-2575 (2004).
- Avila, M. A. Brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 support the survival and neuritogenesis response of developing cochleovestibular ganglion neurons. Dev. Biol. 159 (1), 266-266 (1993).
- Bianchi, L. M., Cohan, C. S. Effects of the neurotrophins and CNTF on developing statoacoustic neurons: comparison with an otocyst-derived factor. Dev. Biol. 159 (1), 353-353 (1993).
- Juurlink, B. e. r. n. h. a. r. d. H. J. Chick Spinal Somatic Motoneurons in Culture. Protocols for Neural Cell Culture.. 59, (2001).
- Fantetti, K. N., Zou, Y., Fekete, D. M. Wnts and Wnt inhibitors do not influence axon outgrowth from chicken statoacoustic ganglion neurons. Hear. Res. , (2011).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-49 (1951).
- Bourikas, D. Sonic hedgehog guides commissural axons along the longitudinal axis of the spinal cord. Nat. Neurosci. 8 (3), 297-297 (2005).
- Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2251 (2005).
- Augsburger, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24 (1), 127-127 (1999).
- Lyuksyutova, A. I. Anterior-posterior guidance of commissural axons by Wnt-frizzled signaling. Science. 302 (5652), 1984-1984 (2003).
