Dissekering och kultur Chick Statoacoustic Ganglion och Spinal explants sladd i Collagen Gel för Neurite utväxt analyser
Summary
Vi visar hur du dissekera och kultur chick E4 statoacoustic ganglion och E6 spinal explants sladden. Explants odlas i serumfritt förhållanden i 3D kollagen geler i 24 timmar. Neurite lyhördhet testas med tillväxtfaktor-kompletterat medium och med protein-belagda pärlor.
Abstract
Den sensoriska organ kyckling innerörat är innerveras av den perifera processer statoacoustic ganglion (SAG) nervceller. Sinnesorgan innervation beror på en kombination av Axon vägledning signaler 1 och faktorer överlevnad 2 längs banan för växande axoner och / eller inom deras sinnesorgan mål. Till exempel genereras funktionella störningar med en klassisk axonet vägledning signalväg, semaphorin-neuropilin, misrouting av öron axoner 3. Även flera tillväxtfaktorer uttryck i sensoriska målen i innerörat, inklusive Neurotrophin-3 (NT-3) och Brain neurotrofa Factor (BDNF), har manipulerats i transgena djur, återigen leder till misrouting av SAG axoner 4. Samma molekyler främja både överlevnad och neurite utväxt av nervceller chick SAG in vitro 5,6.
Här beskriver vi och visar in vitro metod vi nu usjunga för att testa att reagera chick SAG neurites att lösliga proteiner, inklusive kända morfogener som Wnts samt tillväxtfaktorer som är viktiga för att främja utväxt SAG neurite och neuron överlevnad. Med hjälp av detta modellsystem hoppas vi att dra slutsatser om de effekter som utsöndras ligander kan utöva på SAG neuron överlevnad och neurite utväxt.
SAG explants är dissekeras på embryonala dag 4 (E4) och odlas i tredimensionella kollagen geler i serumfritt förhållanden i 24 timmar. För det första är neurite lyhördhet testas genom odling explants med protein kompletterat-medium. Sedan, för att fråga om punktkällor för utsöndras ligander kan ha riktat effekter på neurite utväxt är explants co-odlade med protein-belagda pärlor och analyserade för förmåga pärla att lokalt främja eller hämma utväxt. Vi inkluderar även en demonstration av dissektion (modifierad protokoll 7) och kultur av E6 ryggmärgen explants. Virutinmässigt använder ryggmärgen explants att bekräfta bioaktivitet av proteiner och protein-blöt pärlor, och att bekräfta arter korsreaktivitet med chick vävnad, under samma kultur villkor som SAG explants. Dessa in vitro-analyser är bekvämt för snabb screening av molekyler som utövar trofiska (överlevnad) eller tropiska (riktnings) effekter på SAG nervceller, speciellt innan du utför studier in vivo. Dessutom tillåter denna metod testning av individuella molekyler under serumfritt förhållanden, med hög neuron överlevnad 8.
Protocol
Discussion
Vi presenterar en metod för att dissekera och kultur E4 SAG och E6 spinal explants sladd, från chick, under serumfritt förhållanden. Detta förfarande används idag i vårt labb för att studera effekterna av olika utsöndras ligander på SAG neuron överlevnad och neurite utväxt. Nya aspekter av detta protokoll omfattar användning av en serumfritt system för odling explants och användning av pärlor fuktad med tillväxtfaktorer för att studera effekter på SAG neurite utväxt. En pärla metod som liknar vår h…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av National Institutes of Health Grant RO1DC002756 och Purdue Research Foundation. Vi tackar Doris Wu och Wiese Chang för att få råd med experiment och Rodney McPhail för hjälp med figurer.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Comment |
| Equipment |
|
||
| Dissection microscope |
|
We use a Leica M80 stereomicroscope with brightfield base illumination | |
| Slide warmer | C.S. & E. |
Collagen polymerization | |
| Chicken egg incubator |
|
||
| 37°C/5% CO2 humidified cell culture incubator |
|
||
|
|||
| Dissection Materials |
|
||
| Sylgard© coated petri dish |
|
||
| 24-well cell culture plate | Corning |
3526 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools |
11252-30 | |
| #55 Dumont forceps | Fine Science Tools |
11295-51 | |
| Stainless steel dissecting pins | Fine Science Tools |
26002-10 | Embryo pinning, fine dissection |
| Moria perforated spoon | Fine Science Tools |
10370-17 | Embryo harvest/transfer |
| 200 µl wide mouth pipet tips | Dot Scientific Inc |
118-96R | Explant transfer |
|
|||
| E4 and E6 chicken eggs |
|
||
| Chick Ringer’s solution |
|
Embryo harvest | |
| HBSS | Sigma |
H8264 | SAG dissection |
| L15 medium | Sigma |
L5520 | Spinal cord dissection medium |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals |
S11150 | Spinal cord dissection medium |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments |
501778 | Spinal cord dissection |
|
|||
| Collagen preparation |
|
||
| Rat-tail collagen Type I | BD Biosciences |
354249 | Explant culture |
| 10X PBS (Sterile) |
|
To neutralize collagen | |
| 1N NaOH (Sterile) |
|
To neutralize collagen | |
| Distilled water (Sterile) |
|
To neutralize collagen | |
| pH indicator papers (6.0-8.1) | Whatman |
2629-990 | To check collagen pH |
| 15 ml conical tubes | Dot Scientific Inc |
818-PG | |
| 500 µl wide mouth pipet tips | Dot Scientific Inc |
119-R100 | To pipet collagen |
|
|||
| Explant culture |
|
||
| DMEM/F12 medium | Sigma |
D8437 | Explant culture medium |
| ITS+1 | Sigma |
I2521 | Medium supplement |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen |
15140-122 | Medium supplement |
| CNTF (rat) | Sigma |
C3835 | Medium supplement |
| NT-3 (human) | Sigma |
N1905 | Medium supplement |
| Purified mouse Wnt5a | R&D Systems |
645-WN-010 | |
| Affi-gel Blue gel beads | Bio-Rad |
153-7302 | |
|
|||
| Immunohistochemistry |
|
||
| Paraformaldehyde | Sigma |
P6148 | Fixation |
| PBS |
|
Rinses | |
| Triton X-100 | Sigma |
T9284 | Blocking solution |
| Sodium azide | Sigma |
S8032 | Blocking solution |
| Calf serum | Invitrogen |
16170-078 | Blocking solution |
| Mouse monoclonal IgG2b anti-β Tubulin 1+II antibody | Sigma |
T8535 | Labels cell bodies and neurites |
| Alexa fluor 488 goat anti –mouse IgG2b antibody | Invitrogen |
A21141 | Detects β Tubulin antibody |
| Teflon micro spatula | VWR |
57949-033 | Release collagen gels from well |
Referências
- Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 549-549 (2007).
- Fritzsch, B. Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia. Brain Res. Bull. 60 (5-6), 423-423 (2003).
- Gu, C. Neuropilin-1 conveys semaphorin and VEGF signaling during neural and cardiovascular development. Dev. Cell. 5 (1), 45-45 (2003).
- Tessarollo, L., Coppola, V., Fritzsch, B. NT-3 replacement with brain-derived neurotrophic factor redirects vestibular nerve fibers to the cochlea. J. Neurosci. 24 (10), 2575-2575 (2004).
- Avila, M. A. Brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 support the survival and neuritogenesis response of developing cochleovestibular ganglion neurons. Dev. Biol. 159 (1), 266-266 (1993).
- Bianchi, L. M., Cohan, C. S. Effects of the neurotrophins and CNTF on developing statoacoustic neurons: comparison with an otocyst-derived factor. Dev. Biol. 159 (1), 353-353 (1993).
- Juurlink, B. e. r. n. h. a. r. d. H. J. Chick Spinal Somatic Motoneurons in Culture. Protocols for Neural Cell Culture.. 59, (2001).
- Fantetti, K. N., Zou, Y., Fekete, D. M. Wnts and Wnt inhibitors do not influence axon outgrowth from chicken statoacoustic ganglion neurons. Hear. Res. , (2011).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-49 (1951).
- Bourikas, D. Sonic hedgehog guides commissural axons along the longitudinal axis of the spinal cord. Nat. Neurosci. 8 (3), 297-297 (2005).
- Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2251 (2005).
- Augsburger, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24 (1), 127-127 (1999).
- Lyuksyutova, A. I. Anterior-posterior guidance of commissural axons by Wnt-frizzled signaling. Science. 302 (5652), 1984-1984 (2003).
