Diseksiyon ve Chick Statoacoustic Ganglion ve Kollajen Jeller Omurilik eksplantlar Kültür Neurite akıbet Tahliller
Summary
Biz civciv E4 statoacoustic ganglion ve E6 omurilik eksplantlar incelemek ve kültürüne nasıl gösterilmektedir. Eksplantlarındaki 24 saat için 3D kollajen jel serum serbest koşullar altında kültüre. Neurite yanıt büyüme faktörü desteği orta ve protein kaplı boncuklar ile test edilir.
Abstract
Tavuk iç kulak duyu organları statoacoustic ganglion (SAG) nöronların periferik süreçleri tarafından innerve edilir. Duyu organı innervasyon akson rehberlik yörünge boyunca büyüyen aksonlar ve / veya duyu organı hedeflerine içinde bulunan ipuçları 1 ve hayatta kalma faktörleri 2 bir arada bağlıdır. Örneğin, klasik bir akson rehberlik sinyal yolağı, semaphorin-neuropilin ile fonksiyonel otik aksonlar 3 parazit misrouting oluşturulur. Ayrıca, çeşitli büyüme faktörleri nörotrofin-3 (NT-3) ve beyin türevli Nörotrofik Faktör (BDNF) de dahil olmak üzere, iç kulak duyu hedefler, ifade SAG aksonlar 4 misrouting yeniden lider, transgenik hayvanlar manipüle edilmiştir. Bu aynı molekülleri in vitro 5,6 hayatta kalma ve civciv SAG nöronların neurite akıbet teşvik.
Burada, tarif ve in vitro yöntem şu anda u göstermekbilinen Wnts gibi morphogens yanı sıra SAG neurite akıbet ve nöron hayatta kalma teşvik için önemli olan büyüme faktörleri de dahil olmak üzere çözünür proteinler, civciv SAG neurites yanıt test için şarkı. Bu model sistemi kullanarak, salgılanan ligandlar SAG nöron hayatta kalma ve neurite akıbet uygulamayın ki etkileri hakkında sonuçlara varmak için umuyoruz.
SAG eksplantlar, embriyonik gün 4 (E4) disseke ve 24 saat boyunca serum serbest koşullar altında, üç boyutlu kollajen jel kültür. İlk olarak, neurite yanıt verme, protein takviye orta kültür eksplantlar tarafından test edilir. Daha sonra, salgılanan ligandlar noktası kaynakları neurite akıbet yönlü etkilere sahip olup olmadığını sormak için, eksplantlar protein kaplı boncuklar ile co-kültürlü ve yerel teşvik etmek veya akıbet inhibe boncuk yeteneği test. Ayrıca diseksiyon gösteri (protokol 7 değiştirilmiş) ve E6, spinal kord eksplantlar kültürü içerir. Bizrutin proteinleri ve protein batırılmış boncuklar biyoaktivite onaylamak için omurilik eksplantlar kullanımı ve SAG eksplantlar aynı kültür koşulları altında, civciv dokusu ile türlerin çapraz reaktivite doğrulamak için. In vitro tayinlerde Bunlar hızlı bir şekilde özellikle in vivo çalışmalar gerçekleştirmeden önce, trofik (hayatta kalma) veya SAG nöronlar tropik (yönlü) etkilerini gösterirler molekülleri için tarama için uygundur. Dahası, bu yöntem yüksek nöron hayatta kalma 8, serum serbest şartlar altında bireysel moleküllerin test izin verir.
Protocol
Discussion
Biz bir yöntem serum koşullar altında, civciv, kültür E4 SAG ve E6 omurilik eksplantlar teşrih ve sunar. Bu prosedür şu anda SAG nöron hayatta kalma ve neurite akıbet çeşitli salgılanan ligandlar etkilerinin incelendiği laboratuvarda kullanılır. Bu protokolün Roman yönlerini, kültür eksplantlar ve SAG neurite akıbet etkilerini incelemek için büyüme faktörleri batırılmış boncuk kullanımı için serum ücretsiz sistem kullanımını içerir. Civciv omurilik 10 bizimkine benzer bir …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Hibe RO1DC002756 Enstitüleri ve Purdue Araştırma Vakfı tarafından finanse edildi. Doris Wu ve Wiese Chang Biz deney ve figürleri ile yardım için Rodney McPhail tavsiye için teşekkür ederim.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Comment |
| Equipment |
|
||
| Dissection microscope |
|
We use a Leica M80 stereomicroscope with brightfield base illumination | |
| Slide warmer | C.S. & E. |
Collagen polymerization | |
| Chicken egg incubator |
|
||
| 37°C/5% CO2 humidified cell culture incubator |
|
||
|
|||
| Dissection Materials |
|
||
| Sylgard© coated petri dish |
|
||
| 24-well cell culture plate | Corning |
3526 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools |
11252-30 | |
| #55 Dumont forceps | Fine Science Tools |
11295-51 | |
| Stainless steel dissecting pins | Fine Science Tools |
26002-10 | Embryo pinning, fine dissection |
| Moria perforated spoon | Fine Science Tools |
10370-17 | Embryo harvest/transfer |
| 200 µl wide mouth pipet tips | Dot Scientific Inc |
118-96R | Explant transfer |
|
|||
| E4 and E6 chicken eggs |
|
||
| Chick Ringer’s solution |
|
Embryo harvest | |
| HBSS | Sigma |
H8264 | SAG dissection |
| L15 medium | Sigma |
L5520 | Spinal cord dissection medium |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals |
S11150 | Spinal cord dissection medium |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments |
501778 | Spinal cord dissection |
|
|||
| Collagen preparation |
|
||
| Rat-tail collagen Type I | BD Biosciences |
354249 | Explant culture |
| 10X PBS (Sterile) |
|
To neutralize collagen | |
| 1N NaOH (Sterile) |
|
To neutralize collagen | |
| Distilled water (Sterile) |
|
To neutralize collagen | |
| pH indicator papers (6.0-8.1) | Whatman |
2629-990 | To check collagen pH |
| 15 ml conical tubes | Dot Scientific Inc |
818-PG | |
| 500 µl wide mouth pipet tips | Dot Scientific Inc |
119-R100 | To pipet collagen |
|
|||
| Explant culture |
|
||
| DMEM/F12 medium | Sigma |
D8437 | Explant culture medium |
| ITS+1 | Sigma |
I2521 | Medium supplement |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen |
15140-122 | Medium supplement |
| CNTF (rat) | Sigma |
C3835 | Medium supplement |
| NT-3 (human) | Sigma |
N1905 | Medium supplement |
| Purified mouse Wnt5a | R&D Systems |
645-WN-010 | |
| Affi-gel Blue gel beads | Bio-Rad |
153-7302 | |
|
|||
| Immunohistochemistry |
|
||
| Paraformaldehyde | Sigma |
P6148 | Fixation |
| PBS |
|
Rinses | |
| Triton X-100 | Sigma |
T9284 | Blocking solution |
| Sodium azide | Sigma |
S8032 | Blocking solution |
| Calf serum | Invitrogen |
16170-078 | Blocking solution |
| Mouse monoclonal IgG2b anti-β Tubulin 1+II antibody | Sigma |
T8535 | Labels cell bodies and neurites |
| Alexa fluor 488 goat anti –mouse IgG2b antibody | Invitrogen |
A21141 | Detects β Tubulin antibody |
| Teflon micro spatula | VWR |
57949-033 | Release collagen gels from well |
Referências
- Fekete, D. M., Campero, A. M. Axon guidance in the inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 549-549 (2007).
- Fritzsch, B. Development of inner ear afferent connections: forming primary neurons and connecting them to the developing sensory epithelia. Brain Res. Bull. 60 (5-6), 423-423 (2003).
- Gu, C. Neuropilin-1 conveys semaphorin and VEGF signaling during neural and cardiovascular development. Dev. Cell. 5 (1), 45-45 (2003).
- Tessarollo, L., Coppola, V., Fritzsch, B. NT-3 replacement with brain-derived neurotrophic factor redirects vestibular nerve fibers to the cochlea. J. Neurosci. 24 (10), 2575-2575 (2004).
- Avila, M. A. Brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 support the survival and neuritogenesis response of developing cochleovestibular ganglion neurons. Dev. Biol. 159 (1), 266-266 (1993).
- Bianchi, L. M., Cohan, C. S. Effects of the neurotrophins and CNTF on developing statoacoustic neurons: comparison with an otocyst-derived factor. Dev. Biol. 159 (1), 353-353 (1993).
- Juurlink, B. e. r. n. h. a. r. d. H. J. Chick Spinal Somatic Motoneurons in Culture. Protocols for Neural Cell Culture.. 59, (2001).
- Fantetti, K. N., Zou, Y., Fekete, D. M. Wnts and Wnt inhibitors do not influence axon outgrowth from chicken statoacoustic ganglion neurons. Hear. Res. , (2011).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-49 (1951).
- Bourikas, D. Sonic hedgehog guides commissural axons along the longitudinal axis of the spinal cord. Nat. Neurosci. 8 (3), 297-297 (2005).
- Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2251 (2005).
- Augsburger, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24 (1), 127-127 (1999).
- Lyuksyutova, A. I. Anterior-posterior guidance of commissural axons by Wnt-frizzled signaling. Science. 302 (5652), 1984-1984 (2003).
