Avaliação de mutação somática em células B Ramos, após superexpressão ou Knockdown de genes específicos
Summary
Descrevemos como executar infecções retrovirais ou lentiviral de superexpressão ou shRNA contendo constrói no ser humano Ramos linhagem de células-B e como medida de mutação somática nestas células.
Abstract
Células B começam sua vida com os anticorpos de baixa afinidade gerada pela recombinação V (D) J. No entanto, após a detecção de um patógeno, a variável região (V) de um gene de imunoglobulina (Ig) é mutante aproximadamente 100.000 vezes mais do que o resto do genoma através hipermutação somática (SHM), resultando em alta de 1,2 anticorpos de afinidade. Além disso, a recombinação classe switch (CSR) produz anticorpos com diferentes funções efetoras, dependendo do tipo de resposta imune que é necessário para um determinado patógeno. Ambos RSE e SHM são iniciadas pela ativação induzida citidina desaminase (AID), que deaminatos resíduos citosina no DNA para produzir uracils. Estes uracils são processados por formas propenso a erros de vias de reparo, acabou levando a mutações e recombinação 1-3.
Nossa compreensão atual dos detalhes moleculares da SHM ea RSE vêm de uma combinação de estudos em camundongos, células primárias, linhas de células, e células-fexperimentos ree. Modelos de ratos permanecem o padrão-ouro com nocautes genética mostrando papéis críticos para reparar muitos fatores (por exemplo, Ung, MSH2, MSH6, Exo1 e polimerase η) 4-10. No entanto, nem todos os genes são passíveis de estudos nocaute. Por exemplo, nocautes de várias cadeias duplas proteínas de reparo estão embrionariamente quebrar letal ou prejudicar o desenvolvimento das células B 11-14. Além disso, por vezes, a função específica de uma proteína em SHM ou CSR pode ser mascarada por mais defeitos global causado pelo nocaute. Além disso, desde experimentos em camundongos pode ser demorado, alterando a expressão de genes individuais em linhas de celular tornou-se um passo cada vez mais popular primeiro a identificar e caracterizar genes candidatos 15-18.
Ramos – uma linha de células de linfoma de Burkitt que constitutivamente sofre SHM – tem sido um modelo de celular da linha popular de estudo SHM 18-24. Uma vantagem das células Ramos é que eles têm uma semi built-in conveniente-Quantitativa medida da SHM. Células de tipo selvagem expressar IgM e, como eles peguem mutações, algumas das mutações knock out expressão IgM. Portanto, dosagem de perda de IgM por fluorescência-ativado de varredura de células (FACS) fornece uma rápida leitura para fora para o nível de SHM. A medida mais quantitativa da SHM pode ser obtida diretamente seqüenciamento dos genes dos anticorpos.
Como as células Ramos são difíceis de transfecção, que produzem derivados estáveis que têm aumentado ou abaixado expressão de um gene individual por infectar as células com construções retroviral ou lentiviral que contêm um cassete de superexpressão ou um curto hairpin RNA (shRNA), respectivamente. Aqui, descrevemos como nos infectar as células Ramos e depois usar essas células para investigar o papel de genes específicos em SHM (Figura 1).
Protocol
Discussion
Como discutido anteriormente, os modelos de celular da linha de diversificação de anticorpos se tornaram um popular ponto de partida para identificar novas proteínas que influenciam diferentes etapas durante a diversificação de anticorpos. Apresentamos aqui um método para usar infecção viral às proteínas ou knock-down ou superexpressam na linha de Ramos de células B e em seguida, examinar o impacto sobre a SHM.
Para esses estudos, utilizamos tanto WT Ramos e células AID oi</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O pMSCV-AID-I-Thy1.1 e pKat2 vetores foram um presente amável da DG Schatz eo pVSV-G, PRSV-Rev, e pMDLg / pRRE vetores foram um presente amável da BR Cullen.
Materials
Suggested reagents – most of these may be substituted with similar products from other vendors.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| 6-well clear TC-treated plates | Corning | 3516 | |
| 10 mL BD Luer-Loksyringes | BD Medical | 309604 | |
| 24-well clear TC-treated plates | Corning | 3526 | |
| 96-well clear flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3596 | |
| 100 mm TC-treated culture dishes | Corning | 430167 | |
| Acrodisc syringe filters, 0.45 μm | Pall Life Sciences | 4604 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/mL in water |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | or similar | |
| BD Falcon round bottom polystyrene tubes | BD Biosciences | 352054 | for FACS |
| BOSC 23 cells | ATCC | CRL-11270 | |
| CO2 incubator capable of 37°C | |||
| DMEM (Dulbecco′s modified Eagle′s medium) | Sigma | D6429 | |
| FBS (fetal bovine serum) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 antibody | BioLegend | 202503 | FITC α-Thy1.1 |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11814443001 | |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 | |
| KAPA HiFi DNA polymerase | KAPA Biosystems | KK2101 | |
| LB Broth (lysogeny broth – Luria) Powder | Difco | 240230 | |
| MISSION TRC shRNA bacterial glycerol stock | Sigma | shRNA vectors | |
| NCS (newborn calf serum) | Gemini Bio-Products | 100-504 | |
| PBS (phosphate buffered solution) | Invitrogen | 70011 | diluted to 1x in water |
| PE α-human IgM antibody | BioLegend | 314508 | |
| PGS (penicillin-streptomycin-glutamine solution) | Gemini Bio-Products | 400-110 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 | 10 mg/mL in water |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2495 | |
| Puromycin | Sigma | P8833 | 250 μg/mL in water |
| QIAquick gel extraction kit | QIAGEN | 28706 | |
| Ramos (RA 1) cells | ATCC | CRL-1596 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R8758 | |
| SuperScript II | Invitrogen | 18064-022 | |
| SYBR FAST qPCR kit | KAPA Biosystems | KK4601 | |
| Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 18038-042 | |
| TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | K4520-01 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596-026 | |
| Wizard SV Genomic DNA purification system | Promega | A2361 | |
| X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] | Growcells | C-5687 | 40 mg/mL in DMSO |
Referências
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