Эффективное производство рекомбинантных парвовирус с помощью аденовируса производные системы
Summary
Здесь мы опишем протокол, основанный только на клеточных инфекций, что повышает эффективность рекомбинантного парвовирус более чем в 100 раз по сравнению с другими протоколами в использовании. Этот протокол основан на использовании новых аденовирус 5-помощник на основе содержащий транскрипцию парвовирус В.П. единицы (Ad-VP).
Abstract
Грызун парвовирусов (PV), таких как крысы H-1PV и MVM, малы икосаэдра, одноцепочечной, вирусов ДНК. Их геном состоит из двух промоутеров P4 и P38, которые регулируют экспрессию неструктурных (NS1 и NS2) и капсид белков (VP1 и VP2), соответственно 1. Они привлекают большой интерес в качестве противоопухолевого средства для их онколитических и oncosuppressive способности в то же время, не патогенных для человека 2. NS1 является основным эффекторных вирусных 3 цитотоксичности. В целях дальнейшего повышения их естественной противоопухолевой деятельности, производные от этих векторов были получены заменой ген, кодирующий белки капсида с терапевтическим трансгенов (например, цитотоксический полипептид, цитокинов, хемокинов, гена супрессора опухоли и т.д.) 4. Рекомбинантный парвовирусов (recPVs) вектор сохраняет NS1 / 2 кодирующих последовательностей генома и PV теломеры, которые необходимы для вирусной амплификации ДНК и упаковки. ПроизводствоrecPVs происходит только в клетках производителей (как правило, HEK293T), по совместной трансфекции клеток со второй вектор (pCMV-VP), выражающая ген, кодирующий В.П. белков (рис. 1) 4. RecPV векторов, таким образом, являются репликации неисправен. Хотя recPVs оказалось обладают расширенной oncotoxic деятельности по отношению к родительской вирусы, от которых они были получены, их производство остается серьезной проблемой и сильно затрудняет использование этих препаратов в борьбе с раком клинического применения.
Мы обнаружили, что введение Ad-5 производным вектор, содержащий Е2, Е4 (orf6) и VA РНК генов (например, pXX6 плазмиды) в HEK293T улучшить производство recPVs более чем в 10 раз по сравнению с другими протоколами в использовании. На основании этого вывода, мы построили новый Ad-VP-помощник, который содержит геномную аденовирусной элементы, необходимые для повышения recPVs производства, а также parvovirнам вице-президент ген блок 5. Использование Ad-VP-помощником, позволяет производить REC-клипов, используя протокол, который полностью полагается на вирусную инфекцию шаги (в отличие от трансфекции плазмиды), что делает возможным использование клеточных линий, которые являются трудными для трансфекции (например, NB324K) ( Рис. 2). Мы представляем метод, который значительно повышает количество рекомбинантного вируса производства, снижая время и затраты производства, не влияя на качество конечного продукта 5. Кроме того, крупномасштабное производство recPV (в виде суспензии клеток и биореакторы) теперь возможно.
Protocol
Discussion
Мы показали, что recPV производства может быть повышена за счет наличия аденовирусной элементов генома. Мы увеличили recPV урожайности более чем в 10 раз (с 0,3 до 5 ТУ / клетку), предоставляя элемент генома аденовируса с помощью трансфекции и более чем в 100 раз совместное заражение клеток с Ad-VP-п?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим команду производство DKFZ вирусов и развитие блока, в частности, Маркус Мюллер, Сильвия Münstermann, Барбара Liebetrau, и Мэнди Рошер. Это исследование было частично поддержано грантами от Федерального министерства образования и научных исследований (BMBF) и Гельмгольца в рамках Немецкого Krebsforschungszentrum / Cancéropôle дю Гран-Est совместные программы в прикладной вирусологии опухолей.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Sigma | D5796 |
| MEM | Sigma | M4655 |
| Foetal Bovine Serum | PAA | A15-101 |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 |
| Fugene | Roche | 047097050001 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300062 |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263 |
| Adeno-X Rapid Titer Kit | Clontech | 632250 |
Referências
- Cotmore, S. F., Tattersall, P. Parvoviral host range and cell entry mechanisms. Adv. Virus. Res. 70, 183 (2007).
- Rommelaere, J. Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics. Cytokine Growth Factor Rev. 21, 185 (2010).
- Hristov, G. Through Its Nonstructural Protein NS1, Parvovirus H-1 Induces Apoptosis via Accumulation of Reactive Oxygen Species. J. Virol. 84, 5909-5909 (2010).
- Cornelis, J. J., Salome, N., Dinsart, C., Rommelaere, J. Vectors based on autonomous parvoviruses: novel tools to treat cancer. J. Virol. 6, 193-193 (2004).
- El-Andaloussi, N. Novel adenovirus-based helper system to support production of recombinant parvovirus. Cancer Gene Ther. 18, (2011).
- Kestler, J. cis requirements for the efficient production of recombinant DNA vectors based on autonomous parvoviruses. Hum. Gene. Ther. 10, 1619-1619 (1999).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J. Virol. 72, 2224 (1998).
- He, T. C. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2509 (1998).
- Zolotukhin, S. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene. Ther. 6, 973 (1999).
- Maxwell, F., Harrison, G. S., Maxwell, I. H. Improved production of recombinant AAV by transient transfection of NB324K cells using electroporation. J. Virol. Methods. 63, 129 (1997).
- Wrzesinski, C. Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells. J. Virol. 77, 3851 (2003).
