重组细小病毒与腺病毒派生系统的帮助下高效生产
Summary
在这里，我们描述只对细胞的感染，从而提高重组细小的生产效率超过100倍相比，在使用中的其他协议为基础的协议。此协议依赖于使用一种新型腺病毒含有的细小副总裁转录单位（AD-VP）5，基于辅助。
Abstract
如鼠的H-1PV和MVM的啮齿动物细小病毒（PV），是小二十面体，单链DNA病毒。其基因组包含两个启动子P4和P38调节的非结构性（NS1和NS2）和衣壳蛋白（VP1和VP2），分别为1的表达。他们作为抗癌药物的溶瘤和oncosuppressive能力，而人类2非致病性高利率吸引。 NS1蛋白是该病毒的细胞毒性3的主要效应。为了进一步提高他们的天然抗癌活动，从这些载体的衍生工具已产生取代衣壳蛋白编码基因与治疗基因（ 如细胞毒性多肽，细胞因子，趋化因子，抑癌基因等）4。 （recPVs）重组细小病毒载体保留的NS1 / 2编码序列和光伏病毒DNA扩增和包装所必需的基因组端粒。生产recPVs只发生在生产者细胞（一般染HEK293T），合作的第二个表达载体为VP蛋白编码基因（ 图1）4（PCMV-VP）转染细胞。以这种方式产生的recPV载体是复制缺陷。 ，虽然recPVs证明拥有与尊重父母，他们已产生病毒增强oncotoxic活动，其生产仍然是一项重大的挑战和强烈阻碍了这些药物的使用在抗癌的临床应用。
我们发现，引进含有HEK293T细胞，E2A，E4（ORF6）和VA RNA基因（ 如 pXX6，质粒）提高超过10倍相比，在使用中的其他协议的recPVs生产AD-5派生载体。基于这一发现，我们已经构建一种新型的广告副总裁的助手包含腺病毒基因组元素以及必要加强recPVs生产parvovir我们VP基因单位5。 AD-VP辅助使用，允许生产REC-PVS使用协议，完全依赖于病毒感染步骤（如反对质粒转染），使人们有可能使用难以转染的细胞株（ 如 NB324K）（ 图2）。我们提出了一个方法，大大提高了重组病毒的产生量，降低生产时间和成本，不影响最终产品的质量5。此外，大规模生产的recPV（悬浮细胞和生物反应器）现在是可以想象的。
Protocol
Discussion
我们已经表明，recPV生产，可以增强腺病毒基因组元素的存在。我们已增加超过10倍（从0.3到5 TU /细胞），通过转染腺病毒基因组元素提供超过100倍的合作感染与recPV结合的细胞与AD-VP辅助recPV产量比较传统的协议。这里所描述的协议可以进一步优化，确定交付的腺病毒基因组元素和被感染的AD-VP帮手的最佳浓度为最适当的时机。
较大的转基因（超过1600个碱基）RecPVs是生产效率?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢团队Bioccelerator的病毒生产和开发单位，特别是马库斯·米勒，西尔维娅·明斯特曼，芭芭拉Liebetrau，曼迪罗雪尔。这项研究已部分由联邦教育和研究部（BMBF）和亥姆霍兹联合会在德国Krebsforschungszentrum /杜大CancéropôleEST在应用肿瘤病毒学联合计划的框架内部赠款支持。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Sigma | D5796 |
| MEM | Sigma | M4655 |
| Foetal Bovine Serum | PAA | A15-101 |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 |
| Fugene | Roche | 047097050001 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300062 |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263 |
| Adeno-X Rapid Titer Kit | Clontech | 632250 |
Referências
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