Summary

Preparación y tejido de fibras inmunotinción ratón nerviosas sensoriales que inervan la piel y los huesos de extremidades

Published: January 26, 2012
doi:

Summary

Identificación de inmuno periféricos subtipos de fibras nerviosas sensoriales (y la detección de la expresión de proteínas en ella) son fundamentales para la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la sensación periférica. A continuación se describen los métodos para la preparación de las muestras de los tejidos periféricos / visceral, como los huesos y la piel del miembro, por inmunotinción específica de las fibras nerviosas sensoriales periféricas.

Abstract

Detección y procesamiento primario de los físicos, químicos y térmicos estímulos sensoriales de las fibras nerviosas sensoriales periféricas es la clave para la percepción sensorial en animales y humanos. Estas fibras nerviosas sensoriales periféricas expresan una gran cantidad de receptores y las proteínas de los canales iónicos que detectan e iniciar los estímulos sensoriales específicos. Se dispone de métodos para caracterizar las propiedades eléctricas de las fibras nerviosas sensoriales periféricas que inervan la piel, que también puede ser utilizado para identificar la expresión funcional de proteínas específicas de canales de iones en estas fibras. Sin embargo, los métodos electrofisiológicos similares no están disponibles (y también son difíciles de desarrollar) para la detección de la expresión funcional de los receptores y las proteínas de los canales iónicos en las fibras nerviosas sensoriales periféricas que inervan otras vísceras, incluidos los tejidos más difíciles, como los huesos. Por otra parte, estos métodos electrofisiológicos no puede ser utilizado para determinar la expresión de la proteína no excitabless en las fibras nerviosas sensoriales periféricas. Por lo tanto, la inmunotinción de muestras de tejidos periféricos / visceral de horario de oficina nervio sensorial ofrece la mejor manera posible para determinar la expresión de proteínas específicas de interés en estas fibras nerviosas. Hasta ahora, la mayoría de los estudios de expresión de proteínas en las neuronas sensoriales han utilizado los procedimientos de tinción en los ganglios sensoriales, donde se limita la información a la expresión de proteínas específicas en el cuerpo celular de tipos específicos o subconjuntos de neuronas sensoriales. Aquí mostramos los métodos detallados / protocolos para la preparación de las muestras de los tejidos periféricos / visceral de la inmunotinción de las fibras nerviosas sensoriales periféricas. En especial, detalle los métodos para la preparación de la piel o el plantar biopsia en sacabocados y hueso (fémur) secciones de los ratones de la inmunotinción de las fibras nerviosas sensoriales periféricas. Estos métodos no sólo son clave para la determinación cualitativa de la expresión de proteínas en las neuronas sensoriales periféricas, sino que también proporcionan un método de análisis cuantitativo paradeterminar los cambios en los niveles de expresión de proteínas en los tipos o subconjuntos específicos de las fibras sensoriales, así como para determinar los cambios morfológicos y / o anatómicas en el número y la densidad de las fibras sensoriales en varios estados patológicos. Además, estos métodos no se limitan a la coloración de las fibras nerviosas sensoriales sólo, pero también puede ser utilizado para la tinción de los tipos de fibras nerviosas de la piel, los huesos y el tejido visceral otros.

Protocol

1. Los animales fueron perfundidos Todos los procedimientos con animales realizados en este estudio son aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo de la Universidad de Iowa, y seguir las pautas del NIH para el uso de animales en la investigación. El día antes de la perfusión, preparar 1 litro de solución amortiguadora de fosfato (0,2 M PB en doble destilada H 2 O, pH 7,4), y se almacenan a 4 ° C. Esto será utilizado para los procesos de la perf…

Discussion

Aquí hemos detallado los métodos para la preparación de la piel del ratón y las secciones de tejido óseo para la inmunotinción y detección de las fibras nerviosas sensoriales periféricas. Las secciones producido a partir de biopsias por punción plantar contienen la piel lampiña y peludo, lo que significa que el protocolo puede ser utilizado en cualquier tipo de piel. Estas técnicas también pueden utilizarse para teñir otros tipos de células en estos tejidos (leucocitos, el endotelio vascular, músculo liso…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al Dr. Yuriy M. Usachev por su ayuda en la estandarización inicial de microscopía confocal de imágenes / del ratón plantar inmunotinción de biopsia, y la Dra. Donna L. Hammond, por su ayuda continua y la crítica constructiva en este trabajo. Este trabajo fue financiado por subvenciones del NINDS / NIH (NS069898), y un desarrollo de la idea de concesión de subvenciones del Departamento de Defensa Programa de Investigación de Cáncer de Próstata (DoD-PCRP-101096) para DPM

Materials

Material Name Tipo Company Catalogue No. Comment
3mm Harris Micro-Punch Material Ted Pella 15094  
Perfusion pump Material VWR International 23609-170  
Paraformaldehyde Reagent Fisher Scientific T353  
Picric acid Reagent Sigma-Aldrich 239801  
OCT Embedding compound Reagent Tissue-Tek 4583  
Cyto-Freeze cryogenic aerosol spray Material Control Company 3118  
Goat Serum Reagent Sigma-Aldrich G9023  
Incubation tray and lid for Immunostaining (Large) Material RPI Corp. 248270 (tray)
248270-A (lid)
 
ImmEdge hydrophobic barrier pen Material Vector Laboratories H-4000  
Camel’s Hair Brushes (#1 thickness) Material Ted Pella 11859  
Pro‐Long Gold Mounting medium Reagent Invitrogen P36930  

Referências

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Citar este artigo
Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones. J. Vis. Exp. (59), e3485, doi:10.3791/3485 (2012).

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