Подготовка тканей и Иммуноокрашивание Мыши чувствительные нервные волокна, иннервирующие кожу и кости конечностей
Summary
Иммуноцитохимическая идентификации периферических сенсорных нервных волокон подтипы (и выявления экспрессии белка в них) являются ключом к пониманию молекулярных механизмов, лежащих периферические ощущения. Здесь мы опишем методы подготовки периферического / висцерального образцы тканей, таких как кожа и кости конечностей, для конкретных иммуноокрашивания периферических сенсорных нервных волокон.
Abstract
Обнаружение и первичной обработки физических, химических и термических сенсорных стимулов на периферических сенсорных нервных волокон имеет ключевое значение для чувственного восприятия у животных и человека. Эти периферические чувствительные нервные волокна выразить множество рецепторов и белков ионных каналов, которые обнаруживают и инициировать конкретные сенсорные стимулы. Существуют методы для характеристики электрических свойств периферических сенсорных нервных волокон, иннервирующих кожу, что также может быть использована для выявления функциональной экспрессии специфических белков ионных каналов в этих волокон. Однако подобные электрофизиологические методы недоступны (и также трудно разработать) для выявления функциональных экспрессию рецепторов и ионных каналов белков в периферических сенсорных нервных волокон, иннервирующих других внутренних органов, в том числе самых сложных тканей, таких как кости. Более того, такие электрофизиологические методы не могут быть использованы, чтобы определить выражение не-возбудимых белкаа в периферических сенсорных нервных волокон. Таким образом, иммунной периферической / висцерального образцы ткани для сенсорных fivers нерв обеспечивает наилучший способ определения экспрессии специфических белков интереса к этим нервным волокнам. Пока большая часть экспрессии белка исследований в сенсорных нейронов использовали иммуноокрашивания процедур в сенсорных ганглиях, где информация ограничивается экспрессии специфических белков в теле клетки определенных типов или подмножеств сенсорных нейронов. Здесь мы приводим подробные методы / протоколы для подготовки периферического / висцерального образцы ткани для иммунной периферических сенсорных нервных волокон. Мы специально подробно методы подготовки кожи или подошвенной биопсии и кость (бедро) разделов из мышей для иммунной периферических сенсорных нервных волокон. Эти методы не только ключ к качественного определения экспрессии белка в периферических сенсорных нейронов, но и обеспечить количественный метод анализа дляопределения изменений в экспрессии белка уровней в конкретных типов или подмножеств чувствительные волокна, а также для определения морфологических и / или анатомические изменения в количество и плотность чувствительных волокон при различных патологических состояниях. Кроме того, эти методы не ограничиваются окрашивание только чувствительные нервные волокна, но также может быть использована для окраски любых типов нервных волокон в коже, костях и других висцеральных тканей.
Protocol
Discussion
Здесь мы имеем подробные методы для подготовки кожи мыши и костной ткани разделы для иммунной и обнаружения периферических сенсорных нервных волокон. Разделы производится из подошвенной биопсии удар содержать как голые и волосатые кожи, а это значит протокол может быть использован н?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-ра Юрия М. Усачев за помощь в начальной стандартизации конфокальной микроскопии / изображений мыши подошвенной иммуноокрашивания биопсии и д-р Донна Л. Хаммонд за ее постоянную помощь и конструктивную критику в этой работе. Эта работа финансировалась грантами от NINDS / NIH (NS069898) и Грант Идея развития премию от Министерства обороны простаты Программа исследований рака (DoD-PCRP-101096) для DPM
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue No. | Comment |
| 3mm Harris Micro-Punch | Material | Ted Pella | 15094 | |
| Perfusion pump | Material | VWR International | 23609-170 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Fisher Scientific | T353 | |
| Picric acid | Reagent | Sigma-Aldrich | 239801 | |
| OCT Embedding compound | Reagent | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cyto-Freeze cryogenic aerosol spray | Material | Control Company | 3118 | |
| Goat Serum | Reagent | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Incubation tray and lid for Immunostaining (Large) | Material | RPI Corp. | 248270 (tray) 248270-A (lid) |
|
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Material | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Camel’s Hair Brushes (#1 thickness) | Material | Ted Pella | 11859 | |
| Pro‐Long Gold Mounting medium | Reagent | Invitrogen | P36930 |
Referências
- Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative Composition Alters Distributions of Immunoreactivity for Glutaminase and Two Markers of Nociceptive Neurons, Nav 1.8 and TRPV1, in the Rat Dorsal Root Ganglion. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58, 329-344 (2010).
- Neves, J. D. S., Omar, N. F., Narvaes, E. A. O., Gomes, J. R., Novaes, P. D. Influence of different decalcifying agents on EGF and EGFR immunostaining. Acta Histochemica. 113, 484-488 (2011).
- Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7, 155-159 (1986).
- Yen, L. D., Bennett, G. J., Ribeiro-da-Silva, A. Sympathetic sprouting and changes in nociceptive sensory innervation in the glabrous skin of the rat hind paw following partial peripheral nerve injury. The Journal of Comparative Neurology. 495, 679-690 (2006).
- Boyette-Davis, J., Xin, W., Zhang, H., Dougherty, P. M. Intraepidermal nerve fiber loss corresponds to the development of Taxol-induced hyperalgesia and can be prevented by treatment with minocycline. Pain. 152, 308-313 (2011).
- Bloom, A. P. Breast Cancer-Induced Bone Remodeling, Skeletal Pain, and Sprouting of Sensory Nerve Fibers. The Journal of Pain. 12, 698-711 (2011).
- Constantin, C. E. Endogenous Tumor Necrosis Factor α (TNFα) Requires TNF Receptor Type 2 to Generate Heat Hyperalgesia in a Mouse Cancer Model. J. Neurosci. 28, 5072-5081 (2008).
- Jankowski, M. P. Sensitization of Cutaneous Nociceptors after Nerve Transection and Regeneration: Possible Role of Target-Derived Neurotrophic Factor Signaling. The Journal of Neuroscience. 29, 1636-1647 (2009).
- Jimenez-Andrade, J. M. Pathological Sprouting of Adult Nociceptors in Chronic Prostate Cancer-Induced Bone Pain. J. Neurosci. 30, 14649-14656 (2010).
- Persson, A. -. K. Sodium-calcium exchanger and multiple sodium channel isoforms in intra-epidermal nerve terminals. Molecular Pain. 6, 84-84 (2010).
- Ohshima, M., Miyake, M., Takeda, M., Kamijima, M., Sakamoto, T. Staphylococcal Enterotoxin B Causes Proliferation of Sensory C-Fibers and Subsequent Enhancement of Neurogenic Inflammation in Rat Skin. Journal of Infectious Diseases. 203, 862-869 (2011).
- Johnson, M. S., Ryals, J. M., Wright, D. E. Early loss of peptidergic intraepidermal nerve fibers in an STZ-induced mouse model of insensate diabetic neuropathy. Pain. 140, 35-47 (2008).
