Summary

Tissue Preparering og farging av Mouse Sensoriske nervefibre Innervating Hud og Limb Bones

Published: January 26, 2012
doi:

Summary

Immunocytochemical identifisering av perifere sensoriske nerve fiber undergrupper (og påvisning av protein uttrykk der) er nøkkelen til forståelsen av molekylære mekanismene bak perifere sensasjon. Her vil vi beskrive metoder for utarbeidelse av perifere / visceral vevsprøver, for eksempel hud og lemmer bein, for spesifikke farging av perifere sensoriske nervefibre.

Abstract

Detection og primær behandling av fysiske, kjemiske og termiske sensoriske stimuli av perifere sensoriske nervefibre er nøkkelen til sensorisk persepsjon hos dyr og mennesker. Disse perifere sensoriske nervefibre uttrykker en mengde reseptorer og ion-kanalen proteiner som oppdager og initiere konkrete sensoriske stimuli. Metoder er tilgjengelige for å karakterisere de elektriske egenskapene av perifere sensoriske nervefibre innervating huden, som også kan benyttes til å identifisere funksjonelle uttrykket av spesifikke ionekanal proteiner i disse fibrene. Men lignende elektrofysiologiske metoder ikke er tilgjengelig (og er også vanskelig å utvikle) for påvisning av funksjonelle uttrykk av reseptorer og ion-kanalen proteiner i perifere sensoriske nervefibre innervating andre viscerale organer, inkludert de mest utfordrende vev som bein. Dessuten kan slike elektrofysiologiske metoder ikke kan benyttes til å bestemme uttrykket av ikke-hissige proteinS i perifere sensoriske nervefibre. Derfor gir farging av perifer / visceral vevsprøver for sensorisk nerve fivers best mulig måte å bestemme uttrykket av spesifikke proteiner av interesse i disse nervefibrene. Så langt har det meste av proteinet uttrykket studier i sensoriske nevroner benyttet farging prosedyrer i sensoriske ganglier, hvor informasjonen er begrenset til uttrykket av spesifikke proteiner i cellen kroppen av bestemte typer eller undergrupper av sensoriske nevroner. Her rapporterer vi detaljerte metoder / protokoller for utarbeidelse av perifere / visceral vevsprøver for farging av perifere sensoriske nervefibre. Vi spesielt detalj metoder for utarbeidelse av hud eller plantar punch biopsi og bein (femur) seksjoner fra mus for farging av perifere sensoriske nervefibre. Disse metodene er ikke bare nøkkelen til kvalitativ måling av protein uttrykk i perifere sensoriske nevroner, men også gi en kvantitativ analyse metode forbestemme endringer i protein uttrykk nivåer i bestemte typer eller undergrupper av sensoriske fibre, samt for å bestemme morfologiske og / eller anatomiske endringer i antall og tetthet av sensoriske fibre under ulike patologiske tilstander. Videre er disse metodene ikke begrenset til farging av bare sensoriske nervefibre, men kan også brukes til farging noen typer nervefibre i hud, bein og andre visceral vev.

Protocol

1. Animal Perfusjons Alle dyr prosedyrer utført i denne studien er godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Iowa, og følg NIH retningslinjer for bruk av dyr i forskning. På dagen før perfusjon, forberede en L av fosfat buffer (0,2 M PB i dobbelt destillert H 2 O, 7,4 pH), og oppbevar ved 4 ° C. Dette vil bli brukt for perfusjon og post-fiksering prosesser. På dagen for perfusjon, forberede 500 ml 4,0% Paraformaldehyde i 0.1…

Discussion

Her har vi detaljerte metoder for utarbeidelse av mus hud og benvev seksjoner for farging og påvisning av perifere sensoriske nervefibre. Delene produseres av plantar punsj biopsier inneholder både snau og hårete hud, noe som betyr at protokollen kan brukes på alle hudtyper. Disse teknikkene kan også brukes til å stain andre celletyper i disse vev (f.eks leukocytter, vaskulær endothelia, glatt muskulatur blant annet). Disse metodene gir et utmerket kompromiss mellom optimal ultrastructural bevaring (som oppnås v…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker dr. Yuriy M. Usachev for hans hjelp i den innledende standardisering av konfokalmikroskopi / avbildning av mus plantar punch biopsi farging, og Dr. Donna L. Hammond for hennes videre hjelp og konstruktiv kritikk i dette arbeidet. Dette arbeidet ble finansiert med tilskudd fra NINDS / NIH (NS069898), og en idéutvikling Grant Award fra Department of Defense Prostate Cancer Research Program (DoD-PCRP-101096) til DPM

Materials

Material Name Tipo Company Catalogue No. Comment
3mm Harris Micro-Punch Material Ted Pella 15094  
Perfusion pump Material VWR International 23609-170  
Paraformaldehyde Reagent Fisher Scientific T353  
Picric acid Reagent Sigma-Aldrich 239801  
OCT Embedding compound Reagent Tissue-Tek 4583  
Cyto-Freeze cryogenic aerosol spray Material Control Company 3118  
Goat Serum Reagent Sigma-Aldrich G9023  
Incubation tray and lid for Immunostaining (Large) Material RPI Corp. 248270 (tray)
248270-A (lid)
 
ImmEdge hydrophobic barrier pen Material Vector Laboratories H-4000  
Camel’s Hair Brushes (#1 thickness) Material Ted Pella 11859  
Pro‐Long Gold Mounting medium Reagent Invitrogen P36930  

Referências

  1. Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative Composition Alters Distributions of Immunoreactivity for Glutaminase and Two Markers of Nociceptive Neurons, Nav 1.8 and TRPV1, in the Rat Dorsal Root Ganglion. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58, 329-344 (2010).
  2. Neves, J. D. S., Omar, N. F., Narvaes, E. A. O., Gomes, J. R., Novaes, P. D. Influence of different decalcifying agents on EGF and EGFR immunostaining. Acta Histochemica. 113, 484-488 (2011).
  3. Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7, 155-159 (1986).
  4. Yen, L. D., Bennett, G. J., Ribeiro-da-Silva, A. Sympathetic sprouting and changes in nociceptive sensory innervation in the glabrous skin of the rat hind paw following partial peripheral nerve injury. The Journal of Comparative Neurology. 495, 679-690 (2006).
  5. Boyette-Davis, J., Xin, W., Zhang, H., Dougherty, P. M. Intraepidermal nerve fiber loss corresponds to the development of Taxol-induced hyperalgesia and can be prevented by treatment with minocycline. Pain. 152, 308-313 (2011).
  6. Bloom, A. P. Breast Cancer-Induced Bone Remodeling, Skeletal Pain, and Sprouting of Sensory Nerve Fibers. The Journal of Pain. 12, 698-711 (2011).
  7. Constantin, C. E. Endogenous Tumor Necrosis Factor α (TNFα) Requires TNF Receptor Type 2 to Generate Heat Hyperalgesia in a Mouse Cancer Model. J. Neurosci. 28, 5072-5081 (2008).
  8. Jankowski, M. P. Sensitization of Cutaneous Nociceptors after Nerve Transection and Regeneration: Possible Role of Target-Derived Neurotrophic Factor Signaling. The Journal of Neuroscience. 29, 1636-1647 (2009).
  9. Jimenez-Andrade, J. M. Pathological Sprouting of Adult Nociceptors in Chronic Prostate Cancer-Induced Bone Pain. J. Neurosci. 30, 14649-14656 (2010).
  10. Persson, A. -. K. Sodium-calcium exchanger and multiple sodium channel isoforms in intra-epidermal nerve terminals. Molecular Pain. 6, 84-84 (2010).
  11. Ohshima, M., Miyake, M., Takeda, M., Kamijima, M., Sakamoto, T. Staphylococcal Enterotoxin B Causes Proliferation of Sensory C-Fibers and Subsequent Enhancement of Neurogenic Inflammation in Rat Skin. Journal of Infectious Diseases. 203, 862-869 (2011).
  12. Johnson, M. S., Ryals, J. M., Wright, D. E. Early loss of peptidergic intraepidermal nerve fibers in an STZ-induced mouse model of insensate diabetic neuropathy. Pain. 140, 35-47 (2008).
check_url/pt/3485?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones. J. Vis. Exp. (59), e3485, doi:10.3791/3485 (2012).

View Video