Summary

Tissue Voorbereiding en Immunokleuring van de muis sensorische zenuwvezels innerveren de huid en ledematen Bones

Published: January 26, 2012
doi:

Summary

Immunocytochemische identificatie van perifere sensorische zenuwvezel subtypes (en de detectie van eiwit expressie daarin) zijn de sleutel voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan perifere sensatie. Hier beschrijven we methoden voor de bereiding van perifere / viscerale weefselmonsters, zoals huid en ledematen botten, voor specifieke immunokleuring van perifere sensorische zenuwvezels.

Abstract

Detectie en de primaire verwerking van fysische, chemische en thermische zintuiglijke prikkels door perifere sensorische zenuwvezels is de sleutel tot zintuiglijke waarneming bij dieren en mensen. Deze perifere sensorische zenuwvezels drukken een overvloed aan receptoren en ionkanaal eiwitten die op te sporen en aanzet geven tot specifieke zintuiglijke prikkels. Methoden beschikbaar om de elektrische eigenschappen van perifere sensorische zenuwvezels innerveren de huid, die ook kan worden gebruikt om de functionele expressie van specifieke ion kanaal eiwitten in deze vezels te identificeren karakteriseren. Echter, soortgelijke elektrofysiologische methoden zijn niet beschikbaar (en zijn ook moeilijk te ontwikkelen) voor de detectie van de functionele expressie van receptoren en ionkanaal eiwitten in de perifere sensorische zenuwvezels innerveren andere inwendige organen, inclusief de meest uitdagende weefsels, zoals bot. Bovendien kan een dergelijke elektrofysiologische methoden niet worden gebruikt om de expressie van niet-opgewonden eiwit te bepalens in de perifere sensorische zenuwvezels. Daarom, immunokleuring van perifere / viscerale weefselmonsters voor sensorische zenuw fivers biedt de best mogelijke manier om de expressie van specifieke eiwitten van belang in deze zenuwvezels te bepalen. Tot nu toe hebben de meeste van de eiwitexpressie studies in sensorische neuronen gebruikt immunokleuring procedures in sensorische ganglia, waar de informatie wordt beperkt tot de expressie van specifieke eiwitten in de cel lichaam van specifieke soorten of subsets van sensorische neuronen. Hier hebben we rapport gedetailleerde methoden / protocollen voor de bereiding van perifere / viscerale weefselmonsters voor immunokleuring van perifere sensorische zenuwvezels. We specifiek detail methoden voor de voorbereiding van de huid of plantaire punch biopsie en been (femur) secties van muizen voor immunokleuring van perifere sensorische zenuwvezels. Deze methoden zijn niet alleen essentieel voor de kwalitatieve bepaling van eiwitexpressie in de perifere sensorische neuronen, maar bieden ook een kwantitatieve bepalingsmethode voor dehet bepalen van veranderingen in eiwit expressie niveaus in bepaalde soorten of subsets van sensorische vezels, alsmede voor het bepalen van de morfologische en / of anatomische veranderingen in het aantal en de dichtheid van sensorische vezels tijdens verschillende pathologische toestanden. Verder zijn deze methoden niet beperkt tot de kleuring van enige zintuiglijke zenuwvezels, maar kan ook worden gebruikt voor het kleuren alle soorten zenuwvezels in de huid, botten en andere viscerale weefsel.

Protocol

1. Animal Perfusie Alle dierlijke procedures uitgevoerd in deze studie worden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Iowa, en volg de NIH richtlijnen voor het gebruik van dieren in het onderzoek. Op de dag voor perfusie, bereiden een L van fosfaatbuffer (0,2 M PB in dubbel gedistilleerd H 2 O, pH 7,4), en bewaar bij 4 ° C. Deze zal worden gebruikt voor perfusie en post-fixatie processen. Op de dag van perfusie,…

Discussion

Hier hebben we gedetailleerd de methodes voor de voorbereiding van de huid van muizen en botweefsel secties voor immunokleuring en detectie van perifere sensorische zenuwvezels. De secties uit plantaire stansbiopsieën bevatten zowel kaal en behaarde huid, wat betekent dat het protocol dat gebruikt kan worden op elk huidtype. Deze technieken kunnen ook worden gebruikt om andere soorten cellen vlek in deze weefsels (bijv. leukocyten, vasculaire endotheel, glad spierweefsel onder andere). Deze methoden zorgen voor een uit…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken dr. M. Yuriy Usachev voor zijn hulp bij de eerste standaardisatie van confocale microscopie / beeldvorming van de muis plantaire punch biopsie immunokleuring, en Dr Donna L. Hammond voor haar voortdurende hulp en opbouwende kritiek in dit werk. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van het NINDS / NIH (NS069898), en een idee-ontwikkeling Grant Award van het ministerie van Defensie Prostaatkanker Research Program (DoD-PCRP-101096) om DPM

Materials

Material Name Tipo Company Catalogue No. Comment
3mm Harris Micro-Punch Material Ted Pella 15094  
Perfusion pump Material VWR International 23609-170  
Paraformaldehyde Reagent Fisher Scientific T353  
Picric acid Reagent Sigma-Aldrich 239801  
OCT Embedding compound Reagent Tissue-Tek 4583  
Cyto-Freeze cryogenic aerosol spray Material Control Company 3118  
Goat Serum Reagent Sigma-Aldrich G9023  
Incubation tray and lid for Immunostaining (Large) Material RPI Corp. 248270 (tray)
248270-A (lid)
 
ImmEdge hydrophobic barrier pen Material Vector Laboratories H-4000  
Camel’s Hair Brushes (#1 thickness) Material Ted Pella 11859  
Pro‐Long Gold Mounting medium Reagent Invitrogen P36930  

Referências

  1. Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative Composition Alters Distributions of Immunoreactivity for Glutaminase and Two Markers of Nociceptive Neurons, Nav 1.8 and TRPV1, in the Rat Dorsal Root Ganglion. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58, 329-344 (2010).
  2. Neves, J. D. S., Omar, N. F., Narvaes, E. A. O., Gomes, J. R., Novaes, P. D. Influence of different decalcifying agents on EGF and EGFR immunostaining. Acta Histochemica. 113, 484-488 (2011).
  3. Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7, 155-159 (1986).
  4. Yen, L. D., Bennett, G. J., Ribeiro-da-Silva, A. Sympathetic sprouting and changes in nociceptive sensory innervation in the glabrous skin of the rat hind paw following partial peripheral nerve injury. The Journal of Comparative Neurology. 495, 679-690 (2006).
  5. Boyette-Davis, J., Xin, W., Zhang, H., Dougherty, P. M. Intraepidermal nerve fiber loss corresponds to the development of Taxol-induced hyperalgesia and can be prevented by treatment with minocycline. Pain. 152, 308-313 (2011).
  6. Bloom, A. P. Breast Cancer-Induced Bone Remodeling, Skeletal Pain, and Sprouting of Sensory Nerve Fibers. The Journal of Pain. 12, 698-711 (2011).
  7. Constantin, C. E. Endogenous Tumor Necrosis Factor α (TNFα) Requires TNF Receptor Type 2 to Generate Heat Hyperalgesia in a Mouse Cancer Model. J. Neurosci. 28, 5072-5081 (2008).
  8. Jankowski, M. P. Sensitization of Cutaneous Nociceptors after Nerve Transection and Regeneration: Possible Role of Target-Derived Neurotrophic Factor Signaling. The Journal of Neuroscience. 29, 1636-1647 (2009).
  9. Jimenez-Andrade, J. M. Pathological Sprouting of Adult Nociceptors in Chronic Prostate Cancer-Induced Bone Pain. J. Neurosci. 30, 14649-14656 (2010).
  10. Persson, A. -. K. Sodium-calcium exchanger and multiple sodium channel isoforms in intra-epidermal nerve terminals. Molecular Pain. 6, 84-84 (2010).
  11. Ohshima, M., Miyake, M., Takeda, M., Kamijima, M., Sakamoto, T. Staphylococcal Enterotoxin B Causes Proliferation of Sensory C-Fibers and Subsequent Enhancement of Neurogenic Inflammation in Rat Skin. Journal of Infectious Diseases. 203, 862-869 (2011).
  12. Johnson, M. S., Ryals, J. M., Wright, D. E. Early loss of peptidergic intraepidermal nerve fibers in an STZ-induced mouse model of insensate diabetic neuropathy. Pain. 140, 35-47 (2008).
check_url/pt/3485?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones. J. Vis. Exp. (59), e3485, doi:10.3791/3485 (2012).

View Video