تحضير الأنسجة وImmunostaining من الألياف العصبية الحسية ماوس التعصيب الجلد والعظام الاطراف
Summary
تحديد Immunocytochemical الطرفية من الألياف العصبية الحسية فرعية (والكشف عن بروتين تعبير فيها) هي المفتاح لفهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء الإحساس الطرفية. نحن هنا تصف طرق تحضير عينات الأنسجة المحيطية / الحشوية ، مثل العظام والجلد أطرافهم ، لimmunostaining محددة من الألياف العصبية الطرفية الحسية.
Abstract
كشف والتجهيز الأولي للالفيزيائية والكيميائية وتنمية مداركه الحسية الحرارية بواسطة الألياف العصبية الحسية المحيطية هو مفتاح الإدراك الحسي في الحيوانات والبشر. هذه الألياف العصبية الطرفية الحسية أعرب عدد كبير من المستقبلات والبروتينات التي كشف القناة الايونية والشروع في تنمية مداركه الحسية محددة. الأساليب المتاحة لتوصيف الخصائص الكهربائية للألياف العصبية الحسية المحيطية التعصيب الجلد ، والتي يمكن أيضا أن تستخدم لتحديد التعبير الوظيفي للبروتينات محددة القناة الايونية في هذه الألياف. ومع ذلك ، أساليب مماثلة الكهربية ليست متاحة (وهنا أيضا من الصعب تطوير) للكشف عن التعبير الفنية من المستقبلات والبروتينات القناة الايونية في الألياف العصبية الطرفية الحسية التعصيب الأجهزة الحشوية الأخرى ، بما في ذلك الأنسجة الأكثر تحديا مثل العظام. وعلاوة على ذلك ، لا يمكن أن تكون هذه الطرق الكهربية المستخدمة في تحديد التعبير عن بروتين غير منفعلق في الألياف العصبية الطرفية الحسية. لذلك ، immunostaining عينات الأنسجة المحيطية / المتأصل للfivers العصب الحسي يوفر أفضل طريقة ممكنة لتحديد التعبير عن بروتينات معينة من الاهتمام في هذه الألياف العصبية. حتى الآن ، وقد استخدمت معظم الدراسات التعبير البروتين في الخلايا العصبية الحسية immunostaining الإجراءات في العقد الحسية ، حيث يقتصر المعلومات إلى التعبير عن بروتينات معينة في خلايا الجسم من أنواع معينة أو مجموعات فرعية من الخلايا العصبية الحسية. نحن هنا تقرير مفصل أساليب / بروتوكولات لإعداد عينات الأنسجة المحيطية / المتأصل للimmunostaining من الألياف العصبية الطرفية الحسية. نحن الطرق بالتفصيل على وجه التحديد لإعداد الجلد أو أخمصي لكمة خزعة والعظام (عظم الفخذ) مقاطع من الفئران لimmunostaining الطرفية من الألياف العصبية الحسية. هذه الأساليب ليست المفتاح الوحيد لتحديد نوعية التعبير البروتين في الخلايا العصبية الحسية المحيطية ، ولكن أيضا توفير طريقة المقايسة الكمية للتحديد التغيرات في مستويات بروتين تعبير في أنواع معينة أو مجموعات فرعية من الألياف الحسية ، وكذلك لتحديد التغيرات المورفولوجية و / أو التشريحية في عدد وكثافة الألياف الحسية أثناء حالات مرضية مختلفة. كذلك ، لا تقتصر هذه الأساليب لتلطيخ من الألياف العصبية الحسية فقط ، ولكن يمكن أن تستخدم أيضا لتلطيخ أي نوع من أنواع الألياف العصبية في الجلد والعظام والأنسجة الحشوية.
Protocol
Discussion
هنا وقد فصلنا في طرق تحضير الجلد الماوس والمقاطع النسيج العظمي لimmunostaining واكتشاف الألياف العصبية الطرفية الحسية. المقاطع التي تنتج من الخزعات كمة أخمصي تحتوي على كل من الجلد غير المشعر وشعر ، والذي يعني أنه يمكن استخدام البروتوكول على أي نوع الجلد. ويمكن أيضا أن تستخ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور يوري M. Usachev لمساعدته في توحيد الأولي المجهري مبائر / التصوير من أخمصي الماوس immunostaining خزعة لكمة ، والدكتور هاموند دونا لام لمساعدتها المستمرة والانتقادات البناءة في هذا العمل. وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق المنح المقدمة من NINDS / المعاهد الوطنية للصحة (NS069898) ، ومنح جائزة تنمية فكرة من وزارة الدفاع البروستاتا برنامج أبحاث السرطان (وزارة الدفاع – 101096 – PCRP) لDPM
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue No. | Comment |
| 3mm Harris Micro-Punch | Material | Ted Pella | 15094 | |
| Perfusion pump | Material | VWR International | 23609-170 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Fisher Scientific | T353 | |
| Picric acid | Reagent | Sigma-Aldrich | 239801 | |
| OCT Embedding compound | Reagent | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cyto-Freeze cryogenic aerosol spray | Material | Control Company | 3118 | |
| Goat Serum | Reagent | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Incubation tray and lid for Immunostaining (Large) | Material | RPI Corp. | 248270 (tray) 248270-A (lid) |
|
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Material | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Camel’s Hair Brushes (#1 thickness) | Material | Ted Pella | 11859 | |
| Pro‐Long Gold Mounting medium | Reagent | Invitrogen | P36930 |
Referências
- Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative Composition Alters Distributions of Immunoreactivity for Glutaminase and Two Markers of Nociceptive Neurons, Nav 1.8 and TRPV1, in the Rat Dorsal Root Ganglion. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58, 329-344 (2010).
- Neves, J. D. S., Omar, N. F., Narvaes, E. A. O., Gomes, J. R., Novaes, P. D. Influence of different decalcifying agents on EGF and EGFR immunostaining. Acta Histochemica. 113, 484-488 (2011).
- Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7, 155-159 (1986).
- Yen, L. D., Bennett, G. J., Ribeiro-da-Silva, A. Sympathetic sprouting and changes in nociceptive sensory innervation in the glabrous skin of the rat hind paw following partial peripheral nerve injury. The Journal of Comparative Neurology. 495, 679-690 (2006).
- Boyette-Davis, J., Xin, W., Zhang, H., Dougherty, P. M. Intraepidermal nerve fiber loss corresponds to the development of Taxol-induced hyperalgesia and can be prevented by treatment with minocycline. Pain. 152, 308-313 (2011).
- Bloom, A. P. Breast Cancer-Induced Bone Remodeling, Skeletal Pain, and Sprouting of Sensory Nerve Fibers. The Journal of Pain. 12, 698-711 (2011).
- Constantin, C. E. Endogenous Tumor Necrosis Factor α (TNFα) Requires TNF Receptor Type 2 to Generate Heat Hyperalgesia in a Mouse Cancer Model. J. Neurosci. 28, 5072-5081 (2008).
- Jankowski, M. P. Sensitization of Cutaneous Nociceptors after Nerve Transection and Regeneration: Possible Role of Target-Derived Neurotrophic Factor Signaling. The Journal of Neuroscience. 29, 1636-1647 (2009).
- Jimenez-Andrade, J. M. Pathological Sprouting of Adult Nociceptors in Chronic Prostate Cancer-Induced Bone Pain. J. Neurosci. 30, 14649-14656 (2010).
- Persson, A. -. K. Sodium-calcium exchanger and multiple sodium channel isoforms in intra-epidermal nerve terminals. Molecular Pain. 6, 84-84 (2010).
- Ohshima, M., Miyake, M., Takeda, M., Kamijima, M., Sakamoto, T. Staphylococcal Enterotoxin B Causes Proliferation of Sensory C-Fibers and Subsequent Enhancement of Neurogenic Inflammation in Rat Skin. Journal of Infectious Diseases. 203, 862-869 (2011).
- Johnson, M. S., Ryals, J. M., Wright, D. E. Early loss of peptidergic intraepidermal nerve fibers in an STZ-induced mouse model of insensate diabetic neuropathy. Pain. 140, 35-47 (2008).
