마우스에 γHV68 감염의 측정
Summary
γ – Herpesviruses은 (γ – HVs) 자신의 호스트에서 평생 persistency을 설정합니다. γ – HV68과 생쥐의 감염은 유전자 다루기 쉬운을 제공합니다<em> 생체내에</emγHVs의 라이프 사이클 / pathogenesis의 특성화를 위해> 모델입니다. 이 프로토콜은 플라크 – 형성, 전염성 센터 및 qPCR의 assays에 의해 감염 다음과 같은 급성 및 잠재 단계에서 γHV68 감염의 탐지 및 quantitation을 설명합니다.
Abstract
γ – Herpesviruses은 (γ – HVs) 림프 세포 1 잠재 감염을 수립하는 능력에 대해 주목할 수 있습니다. 이러한 EBV 및 KSHV 인간 γ – HVs의 좁은 호스트 범위는, 심각하게 상세한 병원성 연구를 방해하고 있습니다. Murine γ – herpesvirus 68 (γHV68) 주 γ – HVs 인간과 함께 광범위한 유전 및 생물 학적 유사성이 murid 설치류 2 자연 병원체이다. 바이러스 감염의 다른 단계에 쥐를 근친 계통의 γHV68 감염 등, 평가는 γ – HVs 감염시 바이러스 라이프 사이클과 pathogenesis를 이해하는 중요한 모델을 제공합니다.
비강에 접종되면 폐에서 급성 viremia의 γHV68 감염 결과는 나중에 splenocytes와 호스트 3,4의 생활 전반에 걸쳐 활성화할 수 있습니다 기타 세포의 잠재 감염으로 해결되었는지. 이 프로토콜에서는, 우리는 엉덩이에 플라크 분석을 사용하는 방법을 설명합니다이후 비강 감염 (DPI)의 – 폐에의 전염성 바이러스 titer는 초기 단계 (7 일 5)에서 Vero 세포 monolayers에 homogenates. 급성 감염이 대부분이 취소되는 동안 – 3 주 postinfection, γHV68의 잠재 감염을 14 DPI 주변 설립 이후 생쥐의 비장에서 유지됩니다. 잠재 감염은 대개 바이러스가 잠복 숙박 및 유전자 발현의 대부분을 껐다 의하여, 감염된 조직에서 세포의 매우 작은 인구에 영향을 미칩니다. Latently에 감염된 splenocytes은 저절로 바이러스 잠재 하중을 결정하는 전염성 센터 (IC) 분석에 의해 recapitulated 수있는 조직 문화로 explanting에 따라 바이러스를 재활 성화. 더욱 심하게 및 / 또는 latently 감염된 조직, 정량 실시간 PCR의 바이러스성 게놈 복사의 양을 추정 (qPCR)는 최대한의 감도와 정확성을 위해 사용됩니다. qPCR과 플라크 분석, 및 / 또는 IC 분석의 결과를 결합 분석은 바이러스의 spatiotemporal 프로필을 공개합니다생체내의 복제 및 감염.
Protocol
Discussion
γHV68 널리 인간 γ – HVs 2,4,5의 pathogenesis을 이해하기위한 모델로 사용되고 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 생쥐의 비강 접종 후 γHV68의 급성 및 잠재 감염을 평가하는, 전염성 바이러스 titer에 대한 상패 분석, 바이러스 잠재 부하에 대한 IC 분석 및 바이러스 게놈 하중에 대한 qPCR을 포함하여 세 정기적으로 사용하는 방법을 설명했다.
플라크 분석은 감염된 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 기술적 조언과 르네 일 (캘리포니아 대학, 로스 앤젤레스)와 Seungmin 황 (워싱턴 대학)에서 지원을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 박스터 재단, 건강 보조금 국립 연구소 (C. 리앙에 R01과 R21 CA140964 AI083841)에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Material Name | Preparation Procedure |
| Methylcellulose (MC) overlay medium for viral plaque assay |
|
| Fix/stain medium for plaque assay | 0.2% (w/v) crystal violet in 20% ethanol. |
| ACK Lysis Buffer | NH4Cl 0.15M, KHCO3 10mM, EDTA 0.1mM |
| Complete DMEM | Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen), 2 mM L-glutamine, and 1% penicillin-streptomycin (Gibco-BRL). |
Table 1. Specific media used in this protocol
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1251 |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512-250g |
| 2 x MEM | Life Technologies | 11935 |
| Cell strainer | BD Faclon | 352340 |
| Omni tissue homogenizer | OMNI International | TH115 |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| iQTM SYBRH Green Supermix | BioRad | 170-8882 |
| CFX96 real-time PCR system | Bio-Rad | 184-5072 |
| Cell counter | Bio-Rad | 145-0001 |
| Sorvall SA-600 | Thermo Scientific | 096-124022 |
Table 2. Specific reagents and equipment
Referências
- Damania, B., Choi, J. K., Jung, J. U. Signaling activities of gammaherpesvirus membrane proteins. J. Virol. 74, 1593-1601 (2000).
- Stevenson, P. G., Efstathiou, S. Immune mechanisms in murine gammaherpesvirus-68 infection. Viral. Immunol. 18, 445-456 (2005).
- Flano, E., Husain, S. M., Sample, J. T., Woodland, D. L., Blackman, M. A. Latent murine gamma-herpesvirus infection is established in activated B cells, dendritic cells, and macrophages. J. Immunol. 165, 1074-1081 (2000).
- Sunil-Chandra, N. P., Efstathiou, S., Nash, A. A. Murine gammaherpesvirus 68 establishes a latent infection in mouse B lymphocytes in vivo. J. Gen. Virol. 73, 3275-3279 (1992).
- Simas, J. P., Swann, D., Bowden, R., Efstathiou, S. Analysis of murine gammaherpesvirus-68 transcription during lytic and latent infection. J. Gen. Virol. 80, 75-82 (1999).
- Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J. Clin. Invest. 120, 939-949 (2010).
- Wen, K. W., Damania, B. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV): molecular biology and oncogenesis. Cancer. Lett. 289, 140-150 (2009).
- E, X. Viral Bcl-2-mediated evasion of autophagy aids chronic infection of gammaherpesvirus 68. PLoS. Pathog. 5, e1000609-e1000609 (2009).
- Marques, S., Efstathiou, S., Smith, K. G., Haury, M., Simas, J. P. Selective gene expression of latent murine gammaherpesvirus 68 in B lymphocytes. J. Virol. 77, 7308-7318 (2003).
- McCausland, M. M., Crotty, S. Quantitative PCR technique for detecting lymphocytic choriomeningitis virus in vivo. J. Virol. Methods. 147, 167-176 (2008).
- Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. B cells regulate murine gammaherpesvirus 68 latency. J. Virol. 73, 4651-4661 (1999).
- Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. Macrophages are the major reservoir of latent murine gammaherpesvirus 68 in peritoneal cells. J. Virol. 73, 3273-3283 (1999).
