Imagerie des cellules vivantes de l'apoptose médiée caspase-3 dans les cultures cellulaires immortalisée N19-oligodendrocyte utilisant le<em> NucView</em> 488 caspase-3 du substrat. Cette technique est applicable pour les essais de la mort cellulaire programmée en temps réel dans une variété de types de cellules et de tissus.
Le système nerveux central peuvent éprouver un certain nombre de contraintes et les insultes neurologiques, qui peuvent avoir de nombreux effets indésirables qui aboutira à une réduction de la population neuronale et la fonction. Axones endommagés peuvent libérer des molécules excitatrices comme le potassium ou le glutamate dans la matrice extracellulaire, qui à son tour, peut produire d'autres insultes et les blessures aux cellules gliales de soutien, y compris astrocytes et oligodendrocytes 8, 16. Si l'insulte persiste, les cellules seront soumis à la mort cellulaire programmée (apoptose), qui est réglementée et activée par un certain nombre de bien établie cascades de transduction du signal 14. L'apoptose et une nécrose tissulaire peut survenir après une lésion cérébrale traumatique, ischémie cérébrale, et des convulsions. Un exemple classique de la régulation apoptotique est la famille de cystéine dépendante aspartate-dirigé protéases ou caspases. Protéases activées incluant les caspases ont également été impliqués dans la mort cellulaire en réponse à la neuro chroniquesmaladies dégénératives, y compris la maladie d'Alzheimer, de Huntington et la sclérose en plaques 4, 14, 3, 11, 7.
Dans ce protocole, nous décrivons l'utilisation de la NucView 488 caspase-3 substrat pour mesurer le taux d'apoptose caspase-3 dans la médiation immortalisé N19-oligodendrocytes cultures cellulaires (OLG) 15, 5, suite à une exposition à différents stress extracellulaires tels que des concentrations élevées de de potassium ou le glutamate. La lignée cellulaire immortalisée conditionnellement-N19-OLG (représentant l'ancêtre O2A) a été obtenu auprès du Dr. Anthony Campagnoni (UCLA Semel Institute for Neuroscience) 15, 5, et a déjà été utilisée pour étudier les mécanismes moléculaires de l'expression du gène de la myéline et transduction du signal conduisant OLG différenciation (par exemple, 6, 10). Nous avons trouvé cette lignée cellulaire pour être robuste à l'égard de transfection avec exogènes basique de la myéline des protéines (MBP) construit fusionnée à la GFP soit DP ou (rouge ou vert fluorescent protein) 13,12. Ici, les cultures de cellules N19-OLG ont été traités soit avec du chlorure de potassium 80 mM ou 100 mM glutamate de sodium pour imiter les fuites axonale dans la matrice extracellulaire pour induire l'apoptose 9. Nous avons utilisé un bi-fonctionnelle de la caspase-3 contenant un substrat DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) caspase-3 sous-unités de reconnaissance et d'un colorant liaison à l'ADN 2. Le substrat pénètre rapidement dans le cytoplasme où elle est clivée par la caspase-3 intracellulaires. Le colorant, NucView 488 est libéré et entre dans le noyau de la cellule où il se lie d'ADN et une fluorescence verte à 488 nm, de signalisation apoptose. L'utilisation du NucView 488 caspase-3 substrat permet imagerie des cellules vivantes en temps réel 1, 10. Dans cette vidéo, nous avons également décrire la culture et la transfection de cellules immortalisées N19-OLG, ainsi que des techniques d'imagerie des cellules vivantes.
Même si ce n'est pas le seul produit disponible pour la détection fluorogénique apoptose, il ya plusieurs avantages significatifs à l'utilisation du substrat NucView 488. Un des principaux avantages est la possibilité de suivre l'apoptose dans les cellules vivantes en temps réel, alors que la plupart des produits de remplacement, soit exiger une lyse cellulaire ou la perméabilité des cellules pauvres. Les autres avantages comprennent une grande sensibilité pour la caspase-3 de reconnaissance, de la perméabilité cellulaire élevée, une faible cytotoxicité, et aucune interférence avec la progression de l'apoptose. Le substrat a également fluorescence de fond doux jusqu'à ce qu'il est clivé et pénètre dans le noyau, ce qui élimine la fluorescence de fond. La séquence de reconnaissance de caspase-3 contient trois charges négatives et le colorant de liaison d'ADN a une charge positive 2. Le DEVD-488 NucView molécule a donc une charge nette négative, ce qui empêche l'activation et la fixation de la teinture à l'ADN dans les cellules où la caspase n'est pas actif.
Mala cohérence entre les expériences intaining est nécessaire pour être en mesure d'établir des comparaisons significatives entre les répétitions. Un des principaux paramètres de garder constant est la densité cellulaire, car il influe sur le taux de transfection. Obtenir des taux de transfection élevé dans immortalisé N19-OLG cultures cellulaires est plus difficile que d'autres lignées cellulaires courantes telles que HeLa ou HEK 293, et est fortement dépendante de la densité, dans notre expérience de 12, 13. Nos meilleures efficacités de transfection de ces cellules ont été obtenus avec Fugene HD (Roche) et sont normalement d'environ 15%, mais peut atteindre plus de 30%, selon le construire. Le comptage des cellules permet de suivre l'aide à obtenir des taux de transfection cohérente. Il est également important d'exposer les cellules à partir des traitements différents pour le même degré de stress de l'environnement, en particulier lorsque l'on mesure les taux d'apoptose. Plus précisément, la longueur du temps pendant lequel les cellules sont exposées à des réactifs de transfection, ou le montant de l'exposition lumineuse, sont importantes sur l'environnement variablevariables à considérer, et devrait rester constante à travers des expériences. Pour nos applications, nous avons constaté que la collecte d'un grand nombre de champs de vue offre un échantillon de taille suffisamment grande pour faire des comparaisons statistiquement significative [ibid].
The authors have nothing to disclose.
Ce laboratoire a été financée par les Instituts canadiens de recherche en santé, en sciences naturelles et en génie du Canada et la Société canadienne de la sclérose plaques (SCSP). GSTS a été le récipiendaire du doctorat une bourse d'études de la SCSP. Nous sommes reconnaissants envers le Dr Joan Boggs (Hospital for Sick Children, Toronto) pour de nombreuses discussions utiles et des commentaires sur ce manuscrit. Nous sommes reconnaissants à Biotium pour leur généreux don de 488 supplémentaires NucView caspase-3.
Table of specific reagents and equipment
Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
---|---|---|
NucView 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells | Biotium | 30029 |
FuGENE HD transfection reagent | Roche | 04709705001 |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 31053-028 |
0.25% Trypsin | Gibco | 15050-065 |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483-020 |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 |
#1.5-25 mm glass coverslip | Warner Instruments | 64-0715 |
Chamlide CMB magnetic |
Quorum Technologies | CM-B-40 |
Cellstart tissue culture 10 cm dishes | VWR | 82050-576 |
BD Falcon 6-well tissue culture dishes | VWR | CA62406-161 |