불후의 N19 – oligodendrocyte 세포 문화에 caspase – 3의 중재 apoptosis의 라이브 세포 이미징의를 사용하여<em> NucView</em> 488 caspase – 3 기판. 이 기술은 세포 유형과 조직의 다양한 실시간으로 프로그램된 세포 사망 assays에 대해 적용됩니다.
중추 신경계는 강조하고 궁극적으로의 연결 인구와 기능의 감소로 이어질 수많은 불리한 영향을 미칠 수 신경학적인 모욕의 숫자를 경험할 수 있습니다. 손상된 axons은 차례로, astrocytes와 oligodendrocytes 8, 16을 포함하여 지원 glial 세포에 대한 모욕과 부상을 생산할 수있는 세포외 기질로 칼륨 또는 글루 탐 산염을 포함하여 흥분성의 분자를 릴리스 수 있습니다. 모욕가 지속되면 세포가 잘 설립 신호 전달의 폭포 14 숫자 규제 및 활성화 프로그램 세포 사망 (apoptosis)를 받아야합니다. Apoptosis와 조직 괴사는 외상성 뇌 손상, 뇌성 국소 빈혈과 발작이 끝나면 발생할 수 있습니다. apoptotic 규정의 고전 예제 시스테인 종속 aspartate – 감독 프로 테아제, 또는 caspases의 가족입니다. caspases를 포함한 활성 프로 테아제는 만성 신경에 대한 응답으로 세포의 죽음에 연루되어있다알츠하이머 병, 헌팅턴, 그리고 다중 경화증 4, 14, 3, 11, 7을 포함한 퇴행성 질환.
이 프로토콜에서는 이러한 높은 농도 등 다양한 세포 스트레스에 노출 다음, 불후의 N19 – oligodendrocyte (OLG) 세포 배양 15, 5 caspase – 3 매개 apoptosis의 속도를 측정하는 NucView 488 caspase – 3 기판의 사용을 설명 칼륨 또는 글루 탐 산염. 조건부 – 불후의 N19 – OLG 전지 라인 (O2A의 시조를 대표) 박사는 안소니 Campagnoni (신경 과학에 대한 UCLA 시멜은 연구소) 15, 5로부터 얻은 것입니다, 그리고 이전에 myelin의 유전자 발현과 최고의 신호 전달의 분자 메커니즘을 연구하는 데 사용되었습니다 차별화 (예 : 6, 10) OLG 수 있습니다. 우리는 외인성 myelin 기본 단백질 (MBP)로 transfection에 대하여 강력한 것으로이 세포 라인을 찾았 RFP 또는 GFP (빨간색 또는 녹색 형광 단백질) 13, 중 하나에 융합 구조12. 여기, N19 – OLG 세포 문화는 9 apoptosis 유도하는 세포외 매트릭스에 axonal 누출을 모방 80 MM의 칼륨 염화물 또는 100 MM 나트륨 글루 탐 산염 중 하나와 함께 치료를했다. 우리는 DEVD (ASP – GLU – 발 – ASP) caspase – 3 인식 subunit와 DNA 결합 염료 2를 포함하는 이중 기능성 caspase – 3 기판을 사용. 기판을 신속하게 그것이 세포내 caspase – 3에 의해 죽습니다 세포질로 들어간다. 염료, NucView 488가 발표하고 apoptosis 신호, 488 NM에서 DNA와 fluoresces 녹색 바인딩 위치를 세포 핵을 입력합니다. NucView 488 caspase – 3 기판의 사용은 실시간 1, 10에 살고있는 세포 이미징을 허용합니다. 이 비디오에서는, 우리는 또한 culturing 및 transfection 불후의 N19 – OLG의 세포뿐만 아니라 라이브 세포 이미징 기술을 설명합니다.
이 apoptosis 탐지에 사용할 수있는 유일한 형광 제품이 아니지만, NucView 488 기판을 사용하여 몇 가지 중요한 이점이 있습니다. 주요 혜택 중 하나는 대부분의 다른 제품 중 세포 용해 필요하거나 가난한 세포 투과성을 가지고 반면, 실시간으로 살고 세포에서 apoptosis를 수행하는 능력입니다. 다른 혜택은 caspase – 3 인식, 높은 세포 투자율, 낮은 세포 독성과 apoptosis의 진행과 함께 간섭없이 높은 감도를 포함합니다. 기판은 또한 그것이 죽습 때까지 낮은 배경 형광을 가지고 있으며 배경 형광을 제거 핵을갑니다. caspase – 3 인식 순서는 3 부정적인 요금을 포함하고있는 DNA – 바인딩 염색 한 긍정적인 요금이 있습니다. DEVD – NucView 488 분자 따라서 caspase가 활성화되지 않은 세포의 DNA에 대한 염료의 활성화 및 바인딩을 방지 그물 부정적인 요금을 가지고 있습니다.
엄마실험 사이 intaining 일관성이 복제 간의 의미있는 비교를 그릴 수 있도록해야합니다. 그것이 transfection의 속도에 영향을 미치는 등 일관성 유지의 주요 매개 변수 중 하나는, 세포 밀도이다. 높은 transfection 속도를 얻기 불후의 N19 – OLG 세포 배양하면 같은 HELA 또는 HEK293 같은 다른 일반적인 세포 라인보다 더 어렵습니다, 우리의 경험 12, 13, 밀도에 크게 의존합니다. 이러한 세포에 대한 최고의 transfection 효율이 Fugene HD (Roche는)를 취득하고 일반적으로 약 15 %입니다,하지만 구성에 따라 30 % 이상에 도달할 수있다. 주의 세포 계수는 일관성있는 transfection 속도를 얻기에 도움이됩니다. apoptosis의 속도를 측정하는 특히 다른 치료에서 환경 스트레스의 동일한 정도로 세포를 노출하는 것도 중요하다. 특히, 세포 transfection 시약의, 또는 빛의 노출의 양을에 노출되는 동안 시간의 길이는 중요한 환경 vari 있습니다ables 고려하고, 실험을 통해 지속적으로 유지됩니다. 우리의 어플 리케이션을 위해, 우리는 필드 수준의보기의 다수를 수집하는 것은 통계 – 중요한 비교를 만들기 위해 충분히 큰 표본 크기를 제공하는 것으로 나타났습니다 [ibid].
The authors have nothing to disclose.
이 연구소는 건강 연구의 캐나다 연구소, 자연 과학 및 캐나다 공학 연구 협의회, 캐나다 (MSSC)의 다중 경화증 학회에 의해 지원되었습니다. GSTS는 MSSC에서 박사 학생이기의 수신자했다. 우리는이 원고에 많은 도움이 토론과 의견 박사 조안 Boggs (아픈 어린이, 토론토 병원)에 감사하고 있습니다. 우리는 추가 NucView 488 caspase – 3 그들의 관대한 선물 Biotium에 감사하고 있습니다.
Table of specific reagents and equipment
Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
---|---|---|
NucView 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells | Biotium | 30029 |
FuGENE HD transfection reagent | Roche | 04709705001 |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 31053-028 |
0.25% Trypsin | Gibco | 15050-065 |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483-020 |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 |
#1.5-25 mm glass coverslip | Warner Instruments | 64-0715 |
Chamlide CMB magnetic |
Quorum Technologies | CM-B-40 |
Cellstart tissue culture 10 cm dishes | VWR | 82050-576 |
BD Falcon 6-well tissue culture dishes | VWR | CA62406-161 |