Yeni çok katmanlı bir balon kullanarak Memeli Hücre Kültürü Ölçeği-Up
Summary
Hücreler enstrümantal bir araştırma ve artan bir rol oynar ve yeni terapötikler keşfi ve geliştirilmesi. Eklenti bağımlı hücreler büyüyen ve hasat için daha verimli ve etkin şekilde hücreler daha fazla sayıda bu artan ihtiyacı. Doğru özellikleri ile çok katmanlı bir şişenin bu amaca hizmet edebilir.
Abstract
Giderek artan sayıda hücre tabanlı uygulamalar çok sayıda hücre gerektirir. Hücrelerin çok sayıda gerektiğinde, küçük ölçekli genişleme sırasında yeterli tek katmanlı T-matara, kullanımı, hantal, zahmetli ve zaman alıcı olabilir. Bu ihtiyacı karşılamak için, yeni bir çok katmanlı hücre kültürü geminin performansını kolay ölçekli T-şişeler tek katmanlı hücre kolaylaştırmak için ele alınacaktır. T-175 matara göre 5 kat formatı ve sırasıyla kültür ve tam üç kurtarma ve hücre sayısı beş kat etkinleştirmek – 3 test şişeler mevcuttur. BD Multi-Flask önemli bir özelliği de, damar karıştırma her geminin katmanları içinde ve arasında hücreler ve reaktiflerin yanı sıra tekdüze dağılım ve sürekli olduğu bir ortamda kültüre olabilir hücreleri üretmek hızlı sağlar mix / dengeleme bağlantı noktası T-175 şişeler için uyum.
C için bu Multi-şişeler tasarımı da sağlaronvenient pipet şişeler doğrudan reaktifler ve hücreler ekleyerek değerli hücreleri ve reaktiflerin yanı sıra etkin kurtarma için erişim ve dökme için bağlı kontaminasyon riskini azaltır. Dökme pipetleme tercih edilir uygulamalar için, tasarım, değerli hücreleri ve reaktiflerin israfını azaltmak amacıyla minimal rezidüel sıvı retansiyonu sağlar.
Protocol
Discussion
Bu çalışmada, Multi-Flask tasarım araştırmacılara sunduğu verimlilik artış göstermektedir. Multi-şişeler kullanarak optimum performans için yukarıda belirtilen adımları takip etmek önemli olmakla birlikte, bu protokolü en önemli gördüğü bazı kritik adımlar vardır. Bu bölünme Multi-Flask düz yazılan döşeme katmanları (iii) her birine sıvı bölümleme sonra saat yönünde 45 ° 'lik açıyla Multi-Flask taşıyan gemi, (ii) içinde karıştırın bağlantı noktasını kullanarak hücrelerin ve reaktifler karıştırma (i) inkübatör.
Multi-Flask doğru kullanımı (5) T-175 şişeler için birbiriyle uyumlu bir ortamda kültüre her geminin içinde homojen bir hücre popülasyonu üretimine yol açar. Bu gemiler, T-175 şişesi de benzer bir ayak izi 3 ve 5 kat daha fazla hücre sağlar. 3 ve 5 katlı gemi, sırasıyla 525 ve 875cm 2, büyüme alanı sağlar ve alanı ve işçilik 'ın ikisinin de teklifkullanıcılara avings. Doku Kültürü Yüzey İşleme, böylece gerek kalmadan ölçek sağlayan standart şişeler ile karşılaştırılabilir yeniden optimize mevcut kültür koşulları, kalite, homojenlik veya hücreleri (6, 7) performans ödün. Bu aynı zamanda daha önce toplanan verileri ile karşılaştırılabilir sağlar. Bu gemiler aynı zamanda kollajen gibi reaktifler ile kaplı olabilir, hepatositler 8, kertainocytes 9, serum serbest medya yetiştirilen kök hücreler gibi bazı hücre tiplerinin eki, büyüme ve farklılaşma için özel bir alt tabaka sağlamak için poli-D-lizin, fibronektin formülasyonlar. Kaplama çözümler hücreleri kültür öncesinde kaplama çözümü etkili bir şekilde kaldırılması gibi değerli reaktiflerin israfını azaltmak amacıyla minimal rezidüel sıvı retansiyonu ile kaldırılabilir. Multi-şişeler aralığı 25-50 ml katman başına çevirmek 0,142-0,287 ml / cm 2 kültür hücreleri önerilen en iyi medya hacmi. Çok katmanlı bir başka balon, t aksinekendi ürün sağlayan damar-damar karıştırma her bir geminin içinde ve katmanlar arasındaki hücreler ve reaktiflerin tekdüze dağılım olarak aynı zamanda hızlı bir karışımı-port sunuyor. Çeşitli hücre hatları, primer kültürlerinde ve kök hücre Multi-şişeler ile verimli bir şekilde büyütülüyor edilmiştir. Bu gemiler, yüksek kapasiteli tarama, aşı üretimi, viral vektör transfections ve hücre tedavisi gibi hücre çok sayıda talep uygulamalarında özellikle avantajlıdır.
Zaman, mekan, emek ve daha az atık üretimi Tasarruf tek katmanlı gemiler geleneksel kültürlere karşı Multi-Flask önemli kazançlar. Biz kültürü 5 hasat hücrelerin sayısı yaklaşık üç kat, T-175, 3 kullanarak aynı alanda bulunan şişeler, 5-katlı Multi-şişeler. Bu avantaj, yer tasarrufu T-175, sadece bunlarla sınırlı değildir, ancak aynı zamanda diğer gemilere uzatılabilir: ortak laboratuar inkübatörler evler sığar bir standart silindir şişe aparatı ~ 4 rol850cm 2 yüzey alanı sağlar ler şişeleri her biri (2200 ml). Aynı bölgede, ~~ 20, 5-katlı Multi-şişeler böylece kültür hücreleri beş kat büyüme yüzey sağlayarak yerleştirilebilir. Ayrıca, "Go Green" farkındalık bir artış ile, atık oluşumunu azaltmak için seçenekleri son derece arzu edilir. Bu bağlamda,% 38, T-175 matara ve bu avantajlar ile karşılaştırıldığında Multi-şişeler kullanarak atık üretiminin azalması kurşun (5, T-175 matara, biri 5 katlı Multi-Flask ~ 400g ağırlığında iken ~ 640g ağırlığında) var atık depolama ve bertaraf maliyetleri ve kullanıcıya ekonomik tasarruf sonucu meydana gelen azalma.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalogue # | Comments |
| 3-layer Tissue Culture-treated 525cm2 | BD Biosciences | 353143 | BD Biosciences Cell Culture – BD Falcon Multi-Flasks |
| 5-layer Tissue Culture-treated 875cm2 | BD Biosciences | 353144 | |
| 100ml pipette | BD Biosciences | 357600 | |
| 10 ml pipette | BD Biosciences | 357551 | |
| 5 ml aspirating pipette | BD Biosciences | 357501 | |
| 50 ml Polypropylene conical tube | BD Biosciences | 352070 | |
| T-175 flask Tissue Culture-treated | BD Biosciences | 353028 | |
| Gram Crystal Violet | BD | 212525 | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| GMEM | Sigma | G5154 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| MEM | ATCC | 30-2003 | |
| Trypsin-EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| Fetal Bovine serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Sigma | T8159 | |
| BHK-21 cells | Sigma | 85011433 | |
| Hep-G2, LnCAP | ATCC | ||
| Ecopack 2-293 | Clontech | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polystyrene Bead | PolySciences Inc. | 24628-20 | |
| Bio-Profile Flex Analyzer | Nova BioMedical |
Referências
- Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration mesurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab. Hematol. 10, 109-109 (2004).
- Bonnekoh, B., Wevers, A., Jugert, F., Merk, H., Mahrle, G. Colorimetric growth assay for epidermal cell cultures by their crystal violet binding capacity. Arch. Dermatol. Res. 281, 487-487 (1989).
- Sengupta, N., Rose, S. T., Morgan, J. A. Metabolic Flux analysis of CHO cell metabolism in the late non-growth phase. Biotechnol. Bioeng. 108, 83-83 (2010).
- Zhu, M. M., Goyal, A., Rank, D. L., Gupta, S. K. Effects of elevated pCO2 and osmolality on growth of cells and production of antibody–fusion protein B1: a case study. Biotechnol. Prog. 21, (2005).
- Ryan, J. M., Sharf, B. B., Cristofalo, J. The influence of culture medium volume on cell density and life-span of human diploid fibroblasts. Exp Cell Res. 91, 389-389 (2004).
- Flaherty, P. . Tips and Techniques for enhancing your cell culture. , (2009).
- Sanyal, S., Abraham, E. J., Slater, K., Cai, A., Lacey, B., Hartshorn, C., Flaherty, P., McHugh, B., Qian, S. . Scaling up cells in BD Falcon Cell Culture Multi-Flasks. , (2011).
- DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Mol. Cell. Biol. 11, 4405-4405 (1991).
- Grose, R., Hutter, C., Bloch, W., Thorey, I., Watt, F. M., Fassler, R., Brakebusch, W. S. A crucial role of β1 integrins for keratinocyte migration in vitro and during cutaneous wound repair. Dev. 129, 2303-2303 (2002).
