Расширение масштабов культуры клеток млекопитающих использованием новых многослойных Колба

1. Протокол использовать Multi-Колбы для клеточных культур Подготовка судов и добавлением суспензии клеток Подготовка средний рост клеток по мере необходимости. Выстроить Multi-Колба вертикально на боку с крышкой вверх на рабочую поверхность (стерильные ламинарном боксе). Эти колбы доступны в 3 и 5-слойная форматов и использования подобной работы-картины течения, как T-175 колбу. Ослабить и снять шапки. Добавить необходимое количество подогретого среды в колбе с использованием 50 или 100 мл пипетки или путем заливки. Пипетки, которые ≤ 10 мл может достигать дна сосуда, когда на нескольких Колбы помещают вертикально с крышкой вверх. Пипетки ≥ 10 мл может достигать в сосуд сразу прошлом логотип на Multi-колбу, тем самым обеспечивая удобный портал для добавления большего объема средств массовой информации для судна. Чтобы избежать пузырьков среды, позволяют поток жидкости на этвл вдоль внутренней стенки Multi-колбу крышкой (логотип стороне). Добавить клеточной суспензии из концентрированного фондовом клетки в питательной среде через верхний слой с помощью 10 мл пипетки и крышка фляги. Советы: – Транспорт на нескольких контейнерах на корзину на сайте инкубатора и выполнить оставшиеся шаги. – Плотность клеток посева будет варьироваться в зависимости от типа клеток, средних и необходимости культуры продолжительности. Начните с плотностью посева и средств массовой информации объем, который используется в стандартной Т-175 колб и умножить на 3 или 5 в зависимости от Multi-Колба формат. Смешивание клеток Смешайте позицию: Держите Multi-Колба вертикально с логотипом к себе и повернуть против часовой стрелки, чтобы под углом 45 ° с микс порт к себе. Холдинг под тем же углом, слегка наклонять Multi-Колба спереди назад (шея от себя), пока жидкость в верхнем слое стоков полностью downwarDS через смесь порт. Pivot на смесь левого борта. Точно так же осторожно встряхнуть Multi-колбу от задней стенки к передней (шеи по направлению к вам), пока средний стоков полностью от нижнего слоя к вершине через смесь порт. Повторите шаги 1.2.2 и 1.2.3 еще раз, чтобы обеспечить надлежащее смешивание. Принесите Multi-колбу обратно смешать позицию (шаг 1.2.1) и перейдите к шагу 1,3 Кроме того, клеточная суспензия может быть подготовлен внешне от Multi-колбы и клеточной суспензии могут быть добавлены в сосуд с помощью пипетки или нежный заливки. Смешайте порт позволяет в сосуд смешивания клеток со средствами массовой информации и избавляет от необходимости делать большие объемы клеточные суспензии, внешне. Она также позволяет СМИ выравнивания поперек слоев Multi-Колба Уравновешивание жидкости После смешивания / добавление суспензии клеток, место Multi-Колба вертикально на ровную рабочую поверхность для выравнивания объема жидкости уравнениеlly во всех слоях. Раздела жидкость в каждом слое Держите Multi-Фляга с логотипом к себе и повернуть по часовой стрелке на 45 градусов для разделения жидкости в каждом из слоев. Совет: – Для достижения наилучших результатов, важно использовать ровную рабочую поверхность для Шаги 1.3-1.4 Транспорт После среды, содержащие суспензии клеток разбито, транспорт Multi-колбу, в то же углом 45 ° (по часовой стрелке), как в шаге 1.4.1 со средствами массовой информации от сочетания порта в инкубаторе. Эта позиция подходит также при извлечении колбы из инкубатора для просмотра на микроскоп. Размещение нескольких колбу на полке инкубатора Холдинг Multi-колбу на 45 ° (по часовой стрелке, вдали от микс-порт), осторожно поверните его горизонтально на поверхность инкубатора (с использованием углу от смеси портвращения). Положите Multi-колба с логотипом вверх. Сокол Multi-Колба конструкция позволяет судам для штабелирования и удерживает их на месте с помощью надежное штабелирование ребра. Распределение клеток и реагенты После размещения Multi-Колба квартира на рабочую поверхность, аккуратно рок вперед-назад и из стороны в сторону, чтобы распространять клетки равномерно на поверхности культуры, стараясь не пролить жидкость из каждого слоя. Стек колб. Это колба выполнена из оптически прозрачного материала и клеток на последний слой можно легко просматривать на микроскоп. Медиа-обмен Аспирацию в то время как наклон Multi-Колба влево (смесь левого борта) с логотипом к себе. Затем наклон, Multi-Колба вправо, продолжая аспирации всех остаточных средств массовой информации. Добавить соответствующее количество средств массовой информации и выполните шаги 1.3-1.7 2.Сбор клетки Multi-Колбы Чтобы отделить клетки, выстраиваются на нескольких колб вертикально и принести каждому из них Mix позицию (шаг 1.2.1). Аккуратно инвертировать колбы с шеи к себе с тем чтобы средства массовой информации отводится в верхний слой Multi-Flask. Вставьте 5 или 10 мл аспирационных наконечник через шею, пока не достигнете уровня жидкости вблизи смесь порт. Аспирируйте исчерпаны среды. Добавить диссоциации реагента / промывочного буфера и довести до Mix позиции, как в шаге 1.2.1, а затем приступить и выполните шаги 1.3-1.7. Нейтрализовать со средним ростом / нейтрализующим агентом и залить клеточной суспензии в приемной трубки или инвертировать колбу так, что клетки стекать Верхний слой судна и собрать клетки с помощью 10 мл пипетки. Совет: Для улучшения восстановления клеток или реагенты, довести Multi-Колба смешивать позицию (шаг 1.2.1), инвертировать с шеи по отношению к оператору, чтобы полный дренаж СМИ от др. л слоев для верхнего слоя. Затем наклоните Multi-колбу по часовой стрелке на 45 градусов (от сочетания порта), а Multi-Колба остается перевернутой. Используйте пипетку (1-10 мл), чтобы собрать все оставшиеся реактивы. 3. Рекомендуемый рабочий объем в Соколе Multi-Колбы Рост средств массовой информации 3-слой: 75-150 мл на Multi-Колба 5-слой: 125-250 мл на Multi-Колба Диссоциация агент 3-слой: ≥ 15 мл на Multi-Колба 5-слоя: ≥ 25 мл на Multi-Колба Совет: Начните со средним объемом используется в стандартных Т-175 колб и умножить на 3 или 5 раз в зависимости от Multi-Колба формате оценивается таким образом, чтобы мл на единицу площади поверхности остается той же. 4. Представитель Результаты: 1. Дизайн Сокол Multi-Колба files/ftp_upload/3418/3418fig1.jpg "/> . Рисунок 1: Multi-Колба судов культуре клеток доступны в 3 – и 5-слойная стекируемых формат для расширения масштабов предоставления клетки 525 и 875 см 2 площади поверхности роста, соответственно. Внесите доступа облегчает добавление и удаление клеток и реагентов в-и из сосуда. Наличие микс-порт позволяет быстро в сосуд смешивания и выравнивания СМИ во всех слоях Multi-Flask. 2. Сотовые Доходность использованием Multi-Колба: Эти суда доступны в 3-слойный и 5-слойная форматов, которые соответствуют 3 и 5 раз площадь поверхности Т-175 флаконов. Соответственно, ≥ 3 и 5 раз (130 ± 6,8 х 10 6 и 218 ± 23,6 х 10 6 клеток, соответственно) число ВНК-21 (ребенок почек хомяка) клетки были выращены и оправился от Multi-Колба по сравнению с Т-175 колбы (43,2 ± 3,5 х 10 6 клеток; рис.2а). Сотовые урожайность унит площадь была эквивалентна в 3 – и 5-слойная Multi-Колбы и Т-175 контейнеров для ВНК-21, LNCaP (аденокарциномы предстательной железы человека линии клеток), Нер-G2 (линии клеток человека гепатокарциномы), ECOPACK 2-293 (человека линии клеток почек) культивировали в течение периода 48-96ч (рис.2б) в питательной среде (35 мл на слой) в соответствии с рекомендациями по мобильному поставщика (АТСС, Sigma и / или Clontech). Клетки были перечислены на автоматизированных Vi-CELL счетчик (1). Рисунок 2А: три и в пять раз число ВНК-21 клетки были выращены и оправился от 3 ​​- и 5-слойная Multi-Колбы по сравнению с Т-175 флаконов. Ожидаемая доходность определялась с помощью Средняя урожайность ячейки из-под контроля Т-175 колб, умноженному на три и в пять раз по 3 – и 5-слойная Multi-Колбы соответственно (п = 4 колб / формат). <br/> Рисунок 2B: Сотовый выход на см 2 была эквивалентна в 3 – и 5-слойная Multi-Колбы и Т-175 контейнеров для ВНК-21, LNCaP, HepG2 и EcoPack2-293 клеток. Каждая полоса представляет среднем от 4 до 6 колб. ВНК-21 клеток (11000 cells/cm2) культивировали в течение 72 часов, LNCaP клеток (20000 cells/cm2) и EcoPack2-293 клеток (~ 35000 cells/cm2) культивировали в течение 96 часов и HepG2 клетках (25 000 клеток / см 2 ) культивировали в течение 48 часов до сбора урожая. 3. Медиа распределения между слоями Multi-Колба Сотовые культуральной среде (DMEM; Invitrogen) был добавлен в 5-слойной Multi-колбы (250 mL/5-layer судна) и разбивается на слои в соответствии с протоколом, описанных выше. Медиа распределение измерялось сверления отверстий в каждом слое и СМИ откачивается из отдельных слоев. Вес жидкости оправился от каждого слоя оказалось относительно равномерным от слоя к слою, как показано на рис 3. Они заключаются в следующем: 510,8 ± 0,73, 50,3 ± 0,58, 50,21 ± 0,13, 49,88 ± 0,35, 49,45 ± 0,37 (г). Рисунок 3. Равномерное распределение средств массовой информации в каждой из пяти слоев 5-слойной Multi-Flask. Среду клеточной культуры был добавлен в Multi-колбы (250 ml/5-layer судна), уравновешенной и разделена на отдельные слои. СМИ откачивается через отверстия, просверленные в отдельных пластов и переход жидкости вес был зафиксирован из каждого слоя (п = 6 колб). 4. Сотовые распределения между слоями Multi-Колба Клетки могут быть добавлены и смешанной в пределах нескольких Flask. Мы моделировали распределение клеток между слоями Multi-Колба использованием бисера (10 мкм; PolySciences Inc) близки по размерам к клеткам. Бусы суспензии добавляют в Multi-Колба судна с помощью 10 мл пипетки через верхний слой и смешанные со средствами массовой информации в сосуде, как по убываниюribed в протоколе выше. Бусы распределение измерялось сверления отверстий в каждом слое и жидкости, содержащей бусинку суспензия откачивается из отдельных слоев. Бусы концентрации оправился от каждого слоя было зачитано от счетчика Coulter и зарегистрированы. Ниже приведены эквивалентные межуровневых бусинка распределений в 3-х слойные Multi-колбы (рис.4а). Микс-порт дает возможность равномерного распределения клеток и реагентов между Multi-Колба слоев. Рисунок 4а: Bead распределения в каждой из трех слоев 3-слойный Multi-Flask. Подвески из бисера (3,6 х10 6 / мл) добавляют к среде разливали в Multi-колбы (шарик подвеска: медиа объем составляет 1:10, т.: т.) и смешанные, а затем равновесия и разделов действия, используя протокол, описанный. Бусы концентрации оправился от каждого слоя (перекачиваемой жидкости через отверстия, просверленные на каждом слое) было зачитано от Coulter графаэр и зарегистрированы. Ниже приведены эквивалентные межуровневых бусинка распределений в 3 – слой Multi-колбы (п = 5 колб) Ниже приведены представитель образы Ecopack 2-293 окрашивания моделей клеток, выращенных на> 80% от слияния 3-х слойные Multi-Колбы в средствах массовой информации дополнены роста. Сотовые монослои фиксировали и окрашивали кристаллическим фиолетовым и мульти-Колба слои затем вырезать и отсканированные изображения (2). Обратите внимание, сотовые структурирование была однородной по всем слоям Multi-Колба (Fig.4B). Аналогичные результаты были получены с несколькими типами клеток оценивали (данные не представлены). Рис 4B: Этот рисунок иллюстрирует однородные роста клеток между слоями Multi-колбы. Ecopack-2-293 клеток, выращенных на> 80% слияния в 3-х слойные Multi-Колбы и Т-175 были зафиксированы и окрашивали фиолетовый кристалл. Multi-Колба суда были вырезаны, и каждый окрашенный слой был отсканирован. 5 Подача воздуха в Multi-Flask.: Анализ провел носитель с помощью BioProfile FLEX анализатор (3,4) (Nova биомедицинских) от EcoPack2-293 клетки культивировали в течение 96 часов не выявили различий в воздухе насыщение клеток, выращенных в 5-слойной Multi-Колбы по сравнению с Т-175 колб (81,03 ± 1,9 против 83,4 ± 5,8% окружающего O 2). Рисунок 5: Air насыщения (% окружающего O 2) отработанного СМИ были одинаковыми в предварительно смешанных средств массовой информации из 5-слойной Multi-Колбы по сравнению с Т-175 флаконов. EcoPack2-293 клетки высевали при плотности 35000 клеток / см 2 и культивировали в течение 96 часов до анализа СМИ (п = 3 фляги).