Scale-Up de la culture des cellules de mammifères en utilisant un nouveau flacon multicouches
Summary
Cellules jouent un rôle déterminant et croissant dans la recherche et la découverte et le développement de nouvelles thérapeutiques. Avec ce besoin croissant de plus grand nombre de cellules, nous devons trouver des moyens plus efficaces et plus efficace pour cultiver et récolter les cellules de fixation à charge. Un flacon multicouche avec les bonnes caractéristiques peuvent servir à cette fin.
Abstract
Un nombre croissant d'applications basées sur les cellules nécessitent un grand nombre de cellules. L'utilisation de simple couche t-flacons, qui sont adéquates lors de l'expansion à petite échelle, peut devenir lourd, laborieux et fastidieux lorsque de grands nombres de cellules sont nécessaires. Pour répondre à ce besoin, la performance d'un nouveau multi-couches récipient de culture cellulaire afin de faciliter l'échelle facile de cellules à partir couches simples flacons T sera discutée. Les flacons testés sont disponibles en 3 – et 5-couche de format et de permettre la récupération complète de la culture et de trois à cinq fois le nombre de cellules, respectivement, par rapport à T-175 flacons. Une caractéristique clé de la BD Multi-Ballon est un port de mix / équilibration qui permet rapidement en cuve de mélange ainsi que la distribution uniforme des cellules et des réactifs au sein et entre les couches de chaque navire et produire constamment des cellules qui peuvent être cultivées dans un milieu qui est congru à T-175 flacons.
La conception de ces flacons multi-c permet également del'accès pipette onvenient pour l'ajout de réactifs et de cellules directement dans les flacons ainsi que la récupération efficace des cellules précieuses et des réactifs et réduit les risques de contamination due à la coulée. Pour les applications où versant est préféré au pipetage, la conception permet de rétention de liquide résiduelle minimale afin de réduire le gaspillage de précieuses cellules et des réactifs.
Protocol
Discussion
L'étude actuelle démontre l'augmentation de la productivité que la conception du flacon multi-offre aux chercheurs. S'il est important de suivre les étapes décrites ci-dessus pour des performances optimales lors de l'utilisation multi-flacons, il ya quelques étapes cruciales dans ce protocole qui sont jugées les plus essentielles. Il s'agit notamment (i) le mélange de cellules et de réactifs en utilisant le port mélange dans la cuve (ii) en transportant Multi-ballon à un angle de 45 ° vers la droite après un partitionnement de liquide dans chacune des couches (iii) la pose multi-plates Flacon après partitionnement dans le incubateur.
L'utilisation appropriée de Multi-Flacon conduit à la production d'une population cellulaire homogène au sein de chaque navire qui est cultivée dans un milieu qui est congru à T-175 flacons (5). Ces navires offrent des cellules 3 et 5 fois plus dans un encombrement similaire à celui du flacon T-175. La cuve 3 et 5-couche fournit 525 et 875cm 2 de surface de croissance, respectivement, et offrent à la fois l'espace et du travail savings aux utilisateurs. Le traitement de surface de culture de tissus est comparable à fioles étalons permettant ainsi mise à l'échelle sans avoir besoin de re-optimiser les conditions de culture existantes ou compromettre la qualité, l'homogénéité ou la performance des cellules (6, 7). Cela fournit également des fins de comparabilité avec les données déjà collectées. Ces navires peuvent être également revêtues avec des réactifs tels que le collagène, la fibronectine, la poly-D-lysine pour fournir un substrat spécialisé pour l'attachement, la croissance et la différenciation de certains types cellulaires comme les hépatocytes 8, 9 kertainocytes, les cellules souches cultivées dans un milieu sans sérum formulations. Solutions de revêtement peut être enlevé avec une rétention de liquide résiduelle minimale afin de réduire le gaspillage de précieux réactifs ainsi que l'élimination effective de la solution de revêtement avant la culture de cellules. Le volume optimal recommandé de médias pour des cellules en culture dans des flacons multi-gamme de 0.142 à 0,287 ml / cm 2, qui se traduisent par 25-50 ml par couche. Contrairement à un autre flacon multicouche, tson produit offre un mélange-port dans la cuve qui permet rapidement en cuve de mélange ainsi que la distribution uniforme des cellules et des réactifs au sein et entre les couches de chaque navire. Lignées cellulaires, cultures primaires et les cellules souches ont été élargis de manière efficace à l'aide multi-flacons. Ces navires sont particulièrement avantageux dans les applications qui exigent un grand nombre de cellules comme dans un haut débit de dépistage, la production de vaccins, transfections de vecteurs viraux et de thérapie cellulaire.
Gain de temps, d'espace, le travail et la production de déchets réduits sont les gains clés de la fiole multi-versus cultures conventionnelles en une seule couche navires. Nous pouvons la culture d'environ trois fois le nombre de cellules récoltées à partir de 5, T-175 flacons dans le même espace en utilisant 3, 5-couche multi-flacons. Cet avantage en gain d'espace n'est pas limité seulement à T-175, mais peut aussi être étendue à d'autres navires: un appareil à rouleaux standard bouteille qui s'inscrit dans les incubateurs de laboratoire communs maisons ~ 4 rolbouteilles LER (2200 ml) dont chacune fournit 850cm 2 de surface. Dans la même région, ~ 20, 5-couche multi-flacons peuvent être hébergés offrant ainsi cinq fois la surface de croissance pour les cellules de culture. En outre, avec une augmentation de la «Allez-vert" de sensibilisation, des options pour réduire la production de déchets est hautement souhaitable. À cet égard, il ya un 38% (5, T-175 flacons pèse 640g ~ alors que l'on, à 5 couches multi-Flacon pèse ~ 400g) diminution de la production de déchets à l'aide multi-flacons par rapport à T-175 flacons et ces avantages se traduisent par à diminuer dans le stockage des déchets et les coûts d'élimination et de traduire par des économies pour l'utilisateur.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalogue # | Comments |
| 3-layer Tissue Culture-treated 525cm2 | BD Biosciences | 353143 | BD Biosciences Cell Culture – BD Falcon Multi-Flasks |
| 5-layer Tissue Culture-treated 875cm2 | BD Biosciences | 353144 | |
| 100ml pipette | BD Biosciences | 357600 | |
| 10 ml pipette | BD Biosciences | 357551 | |
| 5 ml aspirating pipette | BD Biosciences | 357501 | |
| 50 ml Polypropylene conical tube | BD Biosciences | 352070 | |
| T-175 flask Tissue Culture-treated | BD Biosciences | 353028 | |
| Gram Crystal Violet | BD | 212525 | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| GMEM | Sigma | G5154 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| MEM | ATCC | 30-2003 | |
| Trypsin-EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| Fetal Bovine serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Sigma | T8159 | |
| BHK-21 cells | Sigma | 85011433 | |
| Hep-G2, LnCAP | ATCC | ||
| Ecopack 2-293 | Clontech | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polystyrene Bead | PolySciences Inc. | 24628-20 | |
| Bio-Profile Flex Analyzer | Nova BioMedical |
Referências
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