مدى متجر يعمل على الكالسيوم<sup> 2 +</supيمكن رصدها> دخول (SOCE) باستخدام فلوري كاليفورنيا<sup> 2 +</sup> المؤشرات. MN<sup> 2 +</sup> التبريد من هذه المقايسات SOCE المؤشرات في الخلايا المستزرعة وألياف العضلات والهيكل العظمي. يوصف أيضا تقنية تسمح قرار المكاني والزماني للSOCE بواسطة التصوير مبائر من ألياف العضلات البشرة ميكانيكيا.
مخزن تعمل كا 2 + دخول (SOCE)، ووصف في وقت سابق capacitative كا 2 + دخول، هي آلية تنظيم محكم لتدفق الكالسيوم خارج الخلية 2 + في الخلايا لتجديد الشبكة الإندوبلازمية المنضب (ER) أو شبكية الهيولى العضلية (ريال) كا 2 + مخازن 1،2. منذ الكالسيوم 2 + هو رسول في كل مكان الثانية، فإنه ليس من المستغرب أن نرى أن SOCE يلعب دورا هاما في مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية، بما في ذلك، وانتشار الخلايا النسخ الجيني، والحركة. بسبب وقوعها واسعة في أنواع خلية تقريبا كل شيء، بما في ذلك الخلايا الظهارية وعضلات الهيكل العظمي، وتلقى هذا المسار اهتماما كبيرا 3،4. ومع ذلك، فإن عدم تجانس الخصائص SOCE في أنواع مختلفة من الخلايا وظيفة فسيولوجية لا يزال غير واضح 5-7.
ويمكن الكشف عن الخصائص الفنية للقناة SOCE من قبل التصحيح، المشبك دراسات، في حين أن مجموعة كبيرة من المعارف حول ثيوقد اكتسبت ق مسار مضان من قبل القائم على الخلايا القياسات الكالسيوم + 2 بسبب الراحة وجدوى عالية الإنتاجية الفرز. والهدف من هذا التقرير هو تلخيص بعض مضان المستندة إلى أساليب لقياس تفعيل SOCE في الخلايا أحادي الطبقة، مع وقف التنفيذ وخلايا الألياف العضلية 5،8-10. الأكثر شيوعا من هذه الأساليب الاستشعاع لمراقبة مباشرة ديناميات الكالسيوم داخل الخلايا 2 باستخدام نسبة F 340nm 380nm و F (510 نانومتر الطول الموجي للانبعاث) من الكالسيوم ratiometric 2 + مؤشر Fura-2 +. لعزل نشاط SOCE أحادي الاتجاه من داخل الخلايا كاليفورنيا الافراج + 2 والكالسيوم 2 + قذف، ويستخدم بشكل متكرر تبريد المنغنيز + 2 الفحص. ومن المعروف MN 2 + لتكون قادرة على تتغلغل في الخلايا عن طريق SOCE بينما هو منيع لعمليات قذف سطح غشاء أو لامتصاص الكالسيوم من ER 2 + مضخات بسبب خفة دم لها قابلية عالية جداح Fura-2. ونتيجة لذلك، والتبريد من مضان-2 Fura الناجم عن دخول المنغنيز 2 + خارج الخلية إلى خلايا يمثل قياس نشاط SOCE 9. لا يمكن أن يؤديها قياس Ratiometric والمقايسات المنغنيز تبريد +2 على مقياس التألق الطيفي كفيت مقرها في زنزانة وضع السكان أو في نظام المجهر القائم على تصور خلايا مفردة. في الاستفادة من القياسات خلية واحدة هي التي يمكن اختيارها الخلايا الفردية التعرض للتلاعب الجيني باستخدام GFP أو طلب تقديم العروض للصحفيين، مما يسمح للدراسات في الخلايا المعدلة وراثيا أو تحور. لا يمكن أن يتحقق الخصائص المكانية من SOCE في الهيكل العظمي والعضلات الهيكلية المتخصصة في ألياف العضلات البشرة من خلال رصد في وقت واحد من اثنين من مضان الكالسيوم منخفضة تقارب 2 + المؤشرات المستهدفة لمقصورات معين من الألياف العضلية، مثل Fluo-5N في ريال وRhod- 5N في الأنابيب عرضية 9،11،12.
على الرغم من أن موجات الإثارة لكا 2 + ملزمة والكالسيوم 2 + مجانا Fura-2 هي 340 نانومتر و 380، على التوالي، ومجموعة أفضل نسبة دينامية Fura-2 لكا 2 قد + قياس تركيز تحدث في موجات أخرى في خاص مجهر النظام. هذه التحولات في الطول الموجي وعادة ما تكون نتيجة للتغيرات في مسار بصري مع إضافة المكونات البصرية المختلفة. في هذه الدراسة تم تحديد موجات الإثارة لFura-2 الى 350 نانومتر و 390 عن طريق إجراء التحليل الطيفي من Fura-2 مضان.
وبين الخلايا الكالسيوم مستوى + 2 في نتائج العصارة الخلوية من التوازن بين مصادر عدة، بما في ذلك داخل الخلايا كا 2 + الإفراج عنهم، خارج الخلية كا 2 + دخول، وكذلك استبعاد الكالسيوم + 2 آلية على غشاء ER والبلازما. لعزل اتجاه شركة نفط الجنوب بوساطة كا 2 + من تدفق الكالسيوم داخل الخلايا الافراج + 2 والكالسيوم 2 + extrusion، يمكن استخدامها في تبريد المنغنيز + 2 الفحص. ومن المعروف MN 2 + لتكون قادرة على تتغلغل في الخلايا عن طريق SOCE بل هو منيع إلى قذف سطح غشاء أو امتصاص الكالسيوم من ER 2 + مضخات. ولذلك، تبريد مضان يمثل قياس اتجاه والمنغنيز 2 + تدفق إلى الخلايا التي تقدر درجة تفعيل SOCE. 2 مليون تتم + فحص التبريد في نقطة isosbestic، في الطول الموجي مثل Fura-2. كثافة مضان مستقلة عن كا 2 + تركيز وينبغي تحديد نقطة isosbestic لكل نظام بواسطة المسح الضوئي طيف. بدلا من ذلك، يمكن تسجيل المنغنيز 2 + التبريد بواسطة مضان المعدلة في أي موجات اثنين في مثل هذه الطريقة أن القيمة النهائية هي مستقلة عن كا 2 + تركيز 13.
للحصول على المعلومات المكانية والزمانية لنشاط SOCE في عضلات الهيكل العظمي، استخدمنا طريقة المزدوجة صبغ، والذي يسمح measureme في وقت واحدNT النشاط SOCE وريال كا 2 + محتوى البالغين في الثدييات البشرة ألياف العضلات مؤسسة كهرباء لبنان. لا يمكن للعلاقة بين التغيرات في كا 2 ريال يتم رسم + المحتوى وSOCE نشاط للدلالة على عتبة وحساسية تفعيل SOCE إلى استنزاف الكالسيوم ريال 2 + تخزين. تم تحسين حل TT-تحميل لتحميل وبالإضافة إلى ذلك تي الأنابيب مع كا 2 + وفتيلة من T-الأنابيب والحل SR-التحميل تم تصميمه لتعزيز القصوى ريال التحميل + كا 2، وبالإضافة إلى ذلك ليتم تحميلها على تي الأنابيب مع ~ 500 ميكرومتر كا 2 +. يتم تضمين FCCP في حل TT / SR-التحميل وحل ريال للأوزون من أجل القضاء على آثار من الميتوكوندريا.
The authors have nothing to disclose.
نشكر الدكتور نوح يسليدر لقراءة وتحرير هذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل UMDNJ مؤسسة أبحاث المنح 62-09 إلى ZP، جمعية القلب الأميركية SDG2630086 إلى XZ، 0535555N إلى ميغابايت، والمعاهد الوطنية للصحة RC2AR058962-01 إلى ميغابايت.
Table of specific reagents and equipment:
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
RPMI 1640 | Mediatech | 10-040-CV | |
Ham’s F-12 | Mediatech | 10-080-CV | |
DMEM | Mediatech | 10-013-CV | |
Glass Bottom Dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
Fura-2 AM | Invitrogen (Molecular Probes) | F1221 | -20°C, seal tight, protected from light, dissolved into DMSO |
Fluo-5N AM | Invitrogen (Molecular Probes) | F14204 | -20°C, seal tight, protected from light |
Rhod-5N | Invitrogen (Molecular Probes) | R14207 | -20°C, seal tight, protected from light |
Quartz Cuvette | Starna Cells | 3-Q-10 | |
thapsigargin | Tocris | 1138 | |
2-Aminoethoxydiphenylborane (2-APB) | Tocris | 1224 | |
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS) | Sigma-Aldrich | 435600 | |
Collagenase Type I | Sigma | C0130 |
Equipment: