이후 3D로 Intracranial 주입 VIVO에서 발광 생물 이미징

1. 세포 배양 GL26 셀 라인은 암 치료와 진단 (DCTD) 국립 암 연구소 (NCI), 프레데릭, MD의 부서로부터 얻은 것입니다. 종양 성장 속도 GL261 세포의 양적 측정을 용이하게하려면 Lenti – X HT 포장 믹스 (Clontech 연구소, 주식 회사)와 FUW -와 Lentiphos HT 시스템 (Clontech 연구소, 주식 회사, 마운틴 뷰, CA)를 사용하여 발광 생물되었다 GL 플라스미드 (JB 루빈, MD, 박사의 실험실에서 후한 선물). 전지는 10% 테트라 사이클린 무료 소태아 세럼 (; Clontech 연구소, 주식 회사 FCS)와 Dulbecco의 변형 이글 배지 (DMEM)에서 유지되었다. GL261 세포도 안정 pGL4.51 [luc2 / CMV / 네오]를 사용하여 유전자 인코딩 luc2로에 의해 지정된 벡터 (Promega 사, 매디슨, WI)과 FuGENE 6 Transfection 시약 (IN Roche는 응용 과학, 인디애나) 다음과 같은 조건을 transfected되었다 제조 업체. luc2 유전자는 반딧불 lucifera의 코돈 최적화된 버전입니다표준 루크 유전자보다 훨씬 높은 광출력을 제공 SE. 안정 transfectants는 10% FCS 및 100 μg / ML Geneticin을 (G418, Invitrogen 사, Carlsbad, CA)가 포함된 DMEM 미디어에서 선택한 유지했다. 전에 이식에 대한 교양 세포는 trypsinzation에 의해 수확 아르 혈청없는 DMEM에 한 번 씻어 1 X 10 7 세포 / ML의 농도에서 혈청없이 DMEM에 resuspended. 2. 수술 설정이 무균 환경은 모든 수술기구, 용품, 장갑, 커튼, 등, 수술 전반에 걸쳐 유지됩니다. 열 주 오래된 C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr (흰둥이 C57BL / 6) 마우스가 프레드릭 동물 생산 프로그램에서 국립 암 연구소에서 구입하여 20g의 평균 중량 (NCI, 프레데릭, MD)에서 사용됩니다. 동물 xylazine (5 밀리그램 / kg), 케타민 (50 MG / kg)과 buprenorphine (0.05 밀리그램 / kg)의 intraperitoneal 주사로 anesthetized 있습니다. 에전자 핀치는 수술이 시작되기 전에 동물이 적절하게 anesthetized 있는지 확인하기위한 것입니다. 동물의 어떤 부분의 운동은 (심지어 약간의 경우) 마취의 수준에있는 감소의 표시입니다. 동물은 즉시 추가 3.3 MG / kg xylazine 및 26.6 밀리그램 / kg 케타민을 주어집니다. 체온은 신체를 덮고 램프와 멸균 드레싱을 사용하여 유지됩니다. 동물이 제대로 anesthetized되면​​, 그들은 stereotactic의 headframe의 쿠션 침대 (모델 900 작은 동물 Stereotaxic, 데이비드 Kopf 인 스트 루먼트) [그림 1]에 표시됩니다. AKWA의 눈물 안과 윤활유 연고 소량의 (4분의 1 인치)는 각막을 통해 적용됩니다. 동물은 동물의 입을 (동물의 턱을 중심으로 검지 손가락과 엄지손가락을 배치) 열고 stereotactic 프레임에 들여쓰기로 가기 앞 치아를 슬라이딩하여 stereotactic 프레임에서 보안이됩니다. 클램프 확실하게 헤드셋에 동물의 머리를 안전하게 강화되어 일전자 머리는 정렬되고 눈은 그러나 동물의 머리에 과도한 힘을 발휘하지 않도록하고, 중심입니다. O이 호스는 동물의 콧구멍 근처에 내려 녹화됩니다. 산소 유량 0.5 L / 분입니다. 허리와 꼬리는 호흡을 손상하지 않도록주의되는 stereotactic 침대로 녹화됩니다. 외과 절개 사이트는 면도 있습니다. Povidine – 요오드 면봉 스틱은 요오드가 동물의 눈을 똑하지 않도록하고, 요오드와 귀 사이의 영역으로 돌아가 눈 사이의 영역을 씻어하는 데 사용됩니다. 세포는 직전 수술에 이식을위한 준비가되어 정기적으로 그들이 정착되지 않도록하기 위해 혼합됩니다. 10 μl은 50mm의 세계 정밀 악기 (WPI), 사라소타, FL, 26 게이지 바늘로 beveled 주사기는 세포 inoculum와 함께로드됩니다. 세포가 함께 clumped 것 같다면 그것은 주사기를 다시로드해야 할 수도 있습니다. 10 μl 주사기는 다음 UMP3 – 1 UltraM에 배치됩니다icroPump 마이크로 주입기 (WPI, 사라소타, FL). 3. Intracranial 주입이 피부 절개는 15 사이즈 메스 블레이드와 이빨 집게를 사용하여 이루어집니다. 10-15밀리미터 절개는 bregma을 (두개골의 맨 위에있는 화살과 코로나 봉합의 교차점) 노출 동물의 귀를 향하고, 길이 방향 동물의 눈 사이에서 이루어집니다. 쉽게 bregma [그림 2] 말초있는 부비동 (副 鼻 洞) 지역과 혼동 수 있습니다 대해 올바르게 bregma를 식별해야합니다. 동물 진정제되면 그것은 0.25 % (2.5 MG / ML) bupivacaine의 내부 incisional 주사를받습니다. burrhole 천천히 두개골을 관통하고 두뇌가 노출 때까지 비틀면서 바늘에 작은 압력을 적용, 16 게이지 1 ½ 인치 바늘 손으로을 왜곡하여 중간선의 오른쪽에 bregma에 후부 0.1 mm와 2.3 mm를 만들 수 있습니다. 주사기 바늘은 microdrive ste를 사용하는 위치에 아래로 이동reotactic 주사기 홀더 (Holder)는 단지 두뇌의 표면을 감동까지. 이 위치에서 바늘은 3 mm의 깊이로 두뇌에 고급이고 3 분 장소에 보관. 바늘은 세포가 들어갈 예정이다 작은 주머니를 만들어, 두뇌의 표면 아래에 2.6 mm의 총 깊이 0.4 mm를 철회합니다. 그것은 적절한 배치와 깊이를 보장하기 위해 동물에 주사 바늘의 X – 선 이미지를이 시점에서 선택 사항입니다. 세포 현탁액을 667 NL / 분의 주입 속도로 2,000 NL (2 μL)의 볼륨에 설정된 마이크로 주입기를 사용하여 삼분 이상 들어갈 수 있습니다. 주사 바늘을 주입의 사이트에서 누출을 방지하기 위해 2 분 동안 자리에 남아 있습니다. 주사 바늘을 천천히 완전히 철회 있습니다. burrhole은 Penfield의 ​​해부학자을 사용하여 뼈 왁스로 가득합니다. 절개는 더 큰 간격이 피부에 남아 없습니다 확인하고 4-0 (1.5 수치) vicryl 봉합사를 사용하여 봉합합니다. Vicryl은 용해 치료 재료입니다의, 따라서 봉합은 절개가 나음을 때 제거하지 않아도됩니다. 수술 후 동물은 30 새장 바닥 표면을 따뜻하게하는 데 필요한 높이 설정된 난방 램프 ° C. 아래 케이지에 넣습니다 동물이 완전히 깨어있는 경우 (같은 새장에 정상적인 운동에 의해 판단) 그들은 집단 주택에 반환됩니다. 구강 이부 프로펜이 포스트 operatively 오일 위해 식수에 추가됩니다. 어린이 이부 프로펜 (100mg/5ml) 100 MG는 표준 473 ML의 쥐 물통에 추가됩니다. 동물은 매일 몇 군데 관찰 3 일마다 무게 있습니다. 두 주 후 주입 관찰은 두 번 하루에 증가합니다. 그들이 hunched 자세, 감소 이동성과 가시 체중 감소를 (≥ 20 %) 포함 감소 건강의 흔적을 보여주 때 동물 euthanized 있습니다. 이러한 증상은 종양에 게시된 반응하고 그들은 reproducibly 전에 종양으로 인한 사망은 약 일일 나타납니다. 4. 생체내에서 </em>는 Bioluminescence 이미징 3 [생활 이미지] 소프트웨어를 시작합니다. IVIS 이미징 시스템은 [초기화 IVIS 시스템] 제어 패널의 하단 오른쪽에있는 버튼을 클릭하면 초기화됩니다. 컨트롤 패널의 상단 왼쪽에있는 [발광] 영상 모드를 선택합니다. luciferin 주입 후 운동 연구가 필요한 영상의 최적의 시간을 확인하려면 [그림 3]. 이 설명은 반딧불 루시페라제입니다; 아래 설명, 동물로, D – luciferin 반딧불 (캘리퍼스 생명 과학 카탈로그 XR – 1001 또는 다른 공급 업체에서 유사한 제품 PBS에 15mg/ml)의 10μl / g 체중을 주사. 3 분 기다렸다가 가스 마취 챔버 (O 2에 2% Isoflurane 가스)에 그것을 배치하여 마우스를 마취. 실로 가스 마취를 끄고 마취 밸브 및 IVIS 매니폴드에 진공을 엽니다. 즉시 진정 동물을 배치온도 제어 이미징 플랫폼에서, 마우스의 콧구멍 제대로 가스 마취 매니폴드에 위치되어 있는지 확인하고. 첫 번째 이미지는 약 5 분 luciferin 주입 후 이동한다. 최대 5 동물은 IVIS 스펙트럼 악기에 한 번에 몇 군데하실 수 있습니다. 미만 5 동물이 몇 군데 수있다면, 그것은 isoflurane 가스를 절약하기 위해 사용하지 않은 매니폴드 (들)을 플러그인 할 수 있습니다. luciferin 표현을위한 운동 곡선을 생성하는 시간에 대한 순서를 생성하여 이미지를 매 3 분 걸릴 계속. 제어판에서 [시퀀스 설정] 버튼을 클릭합니다. 시퀀스 편집기가 나타납니다. 제어 패널에서 시퀀스의 첫 번째 발광 생물 이미지에 대한 설정을 지정합니다. 우리는 중간 Binning부터 시작하는 것이 좋습니다. 우리는 또한 최적의 노출 시간을 결정하는 자동 노출을 권장합니다. 시퀀스 편집기에서 [지연] 버튼을 선택합니다ND는 각 인수 사이 삼분의 지연 시간을 지정합니다. 클릭 시퀀스 편집기에서 [추가]합니다. 취득 매개 변수는 다음 테이블에 추가됩니다. 순서의 각 이미지에 대해 4 단계를 반복합니다. 커브가 설립되면, 최적의 이미징 시간은 신호의 강도 (강도) 대 시간을 음모에 의해 결정하실 수 있습니다. 생체내 광자에서 최고의 시간에 이미지 동물은 가장 강력하고 정확한 신호를 얻을 계산합니다. luciferin의 intraperitoneal (IP) 분사를 사용하여 초기 실험은, 그러나, IP 주사는 종종 종양의 bioluminescence없이 거의 보여주는 간헐적인 결과에 결과. 우리는 신호의 가끔 무작위 부족은 대장이나 다른 내부 장기에 luciferin의 전달에 의한 것을 가상. 따라서 피하 (SC) luciferin 주사를 사용하기 시작하고 큰 이미지 재현성을 봤어요 [그림 3]. 스물SC 주입 후 분 동물들은 응답 때까지 O 2에 2% Isoflurane 가스 챔버에 배치하여 anesthetized 있습니다. anesthetized 동물 (들)은 이미징 챔버로 이동됩니다. 안과 연고 때문에 영상의 길이의 운동 학습을위한 사용해야합니다. 그들은 짧은 기간이 있기 때문에 이것은 다른 이미징 절차 필요하지 않습니다. 이미지가 5 분 노출 시간 중간 binning에서 취득합니다. 자동 수집 옵션도 사용할 수 있습니다. 신호가 포화 및 / 또는 중간 binning에 희미한 경우, binning 또는 노출 시간을 조정할 수 있습니다. 프로그램 파일과 후속 이미지 의견은 사용자의 컴퓨터 디렉토리에 저장됩니다. 5. 3D 이미징 3 [시퀀스 설정] 제어판 창에서 [이미징 마법사] 탭을 클릭합니다. 이미징 이미징 마법사 시작 화면 모드와 CL [Bioluminescence]를 선택합니다ick [다음]. "Bioluminescence – DLIT"에서 이미지 마법사 창에서 [반딧불] 기자 프로브를 선택합니다. 선택한 반딧불 소스 스펙트럼의 방출 / 여기가 취득하는 여섯 해당 필터 선택과 함께 나타납니다. 마지막 화면은 자동 노출 인수 매개 변수와보기 C. 기본 설정 필드의 아주 잘 작동을 포함 기본 선택 사항이 나타납니다, 필요한 경우에는 이러한 설정을 수정할 수 있습니다. 클릭하여 [다음]과 시퀀스 편집기 창 20 nm의 넓은 필터 (560 NM, NM 580, 600nm, 620 nm의, 640 nm의, 그리고 660nm) 여섯 스펙트럼 영역의 순서로 채워집니다. 보도 [순서를 취득]. 첫 번째 필터 (560 나노미터)는 표면 지형을 수립하기 위해 레이저 검류계를 사용하여 구조화 조명 패턴을 포함합니다. 도구 팔레트에서 [표면 지형] 탭을 선택합니다. 표면 다듬기는 재건 과정에서 만든 날카로운 각도에 대해 계정에 적용할 수 있습니다.기본 낮은 스무딩을 권장합니다. 를 클릭 [만들기]와 tomography 분석 상자가 나타납니다. [다음]을 누른 다음 전체 동물을 포함하는 작물 상자를 그려합니다. 임계값 도구는 선택된 영역 위에 보라색 마스크로 표시됩니다. 마스크는 자동으로 동물의 사진을 일치하도록 설정해야합니다. 필요한 경우,보다 적절하게 동물의 개요에 맞게 마스크의 한계를 조정합니다. 클릭 [마침] 및 복원 메쉬가 나타납니다. 재건축은 다음 결과 탭에서 저장할 수 있습니다. 동물의 표면 지형의 생성 다음, [DLIT 3D 재건]로 이동 도구 팔레트에있는 드롭 다운. [분석] 탭 아래의 재건을 수행하기 위해 모두 여섯 파장을 선택합니다. 600 아래의 포화 픽셀 카운트를 굴복 선택을 취소 이미지. 기본값으로 [매개 변수] 탭에서 설정을 둡니다. [속성] 탭에서 "근육이"에 대한 기본 선택 항목으로 나열되어야합니다R 조직 등록 정보 "반딧불"은 소스 스펙트럼으로 표시되어야합니다. 클릭 분석 탭 아래에있는 [재구성]을, 그리고 동물의 표면과 신호 소스의 해당 재건의 3D 재구성 [4 그림]가 나타납니다. 신호 위치와 강도를 확인하려면, 도구 팔레트의 3D 도구 탭의 Voxels 버튼을 선택합니다. 모든 표시 voxels 주위에 사각형을 그릴과 전체 흐름 측정은 볼륨 탭의 하단에 표시됩니다. 선택한 voxels의 신호 위치를 확인하기 위해 [질량 센터]를 클릭하십시오. 동물의 코로나, 화살 및 transaxial 조각이 표시 및 [측정 커서 표시]를 사용하는 것입니다 voxel 센터 동물의 표면에서 거리를 측정할 수 있습니다. 장기 atlases 및 기타 고급 기능의 공동 등록에 대한 자세한 내용은 생활 이미지 소프트웨어 사용자의 설명서를 참조하십시오. 6. 데이터nalysis 3 이미지를 획득하여 저장 후, [찾아보기] 버튼을 클릭하고 파일을 선택하여 프로그램 파일을 액세스할 수 있습니다. 이미지 정보는 [보기]에서 확인하실 수 있습니다 → [이미지 정보]. 신호의 강도는이자 (ROI) [투자 수익 (ROI)을 도구] 단추의 지역을 선택하여 계량하실 수 있습니다. 이미지가 이미지 컨트롤 패널의 왼쪽 상단 모서리에있는 드롭 다운 목록에서 "광자"를 선택하여 [광자] 모드에서 분석되어 있는지 확인하십시오. "유형"드롭 다운 목록에서 [측정 투자 수익 (ROI)] 버튼을 선택합니다. 관심의 투자 수익 (ROI) 모양을 선택, 옵션 서클, 광장, 그리고 또는 그리드를 포함합니다. 획득한 이미지에 강도의 모든 영역을 커버. 투자 수익 (ROI) 위치는 발광 생물 신호를 포함하는 지역으로 투자 수익 (ROI) 형상 선택을 드래그하여 설정됩니다. 투자 수익 (ROI)의 신호 강도는 버튼 [측정]을 클릭하여 계산됩니다. 투자 수익 (ROI) 레이블 강도를 표시합니다. 투자 수익 (ROI)의가 관리하고 usi를 저장할 수 있습니다NG 생활 이미지 소프트웨어. 7. 대표 결과 : 이식 세포 수술 당일 IVIS 스펙트럼을 사용하여 감지하는 경우 성공적인 세포 주입은 분명하다. GL261 룩과 GL261 – luc2 세포 모두가 감지되고 그러나 luc2 유전자는 bioluminescence의 높은 수준의 [그림 5]를 제공합니다. 빨리 이식 후 촬영한 이미지를 배경으로 무시되어야하는 동물의 발 및 코를 아닌 특정 신호가있을 수 있습니다. 이식의 사이트에있는 신호는 실제와 신호 시간 [그림 6]을 증가합니다. 일 6 신호 강도의 하락은 재현성과 이식 세포의 일부로 받아 종양의 손실로 인해 가장 가능성이 높습니다. 종양 부담의 양적 측정은 동물이 궁극적으로 질병에 succumbs 때까지 그들이 꾸준히 상승해야한다는 점에서 재현할 수 있습니다. 그러나, 성장 곡선은 크게 이식 세포의 상태, 그리고 또는 불가 피한 사소한 var에 따라 달라집니다 주입 절차 iability. 저희 연구실은 모든 삼일 이미지를 심어 동물 선출했다. 마우스가 제대로 anesthetized 후 그림은 1., 그것은 stereotactic 프레임에 배치됩니다. 마우스 머리는 입 클램프를 사용하여 보안됩니다. 그림 2. 피부가 기본 해부 랜드마크가 bregma, 코로나와 화살 봉합을 포함 포함하여 식별됩니다 열립니다 후. burrhole은 두개골을 관통하고 두뇌가 노출 될 때까지 천천히 압력 작은 양의 16 게이지 1 ½ 인치 바늘을 왜곡하여 bregma의 오른쪽에있는 2.3mm 이루어집니다. 그림 3. 피하의 운동 비교 (iles/ftp_upload/3403/3403fig3_1.jpg "고도 ="Figure3.1 "/>) 비교 intraperitoneal ( ) luciferin 주입은 피하 luciferin 분사의 유틸리티를 설명하기 및 이미지 다음 luciferin 관리에 최적의 시간을 확인하기 위해 수행되었다. luciferin 후 3 분은 마우스가, 진정 IVIS 스펙트럼 악기의 배치와 bioluminescence의 운동 곡선을 생성하는 데 그 후 시간 매 6 분 동안 매 3 분까지 몇 군데했습니다 주입했다. 이것은 luciferin 행정 피하 경로는 우리 손에 intraperitoneal 주사 우수한되었고, 이미지 동물을 위해 최적의 시간이 GL261 룩 전지의 사용 때 luciferin 주사를 따라 약 25 분 한 그 보여주었다. 3 차원 reconst의 그림 4. 여러보기GL261 – luc2 세포의 주입 intracranial의 소란은 마우스의 골격과 두뇌와 공동 등록. 그림 5. GL261 룩 세포 VS GL261 – luc2 세포에서 발생하는 종양에서 얻은 광자 계산됩니다. 결과는 5 동물의 평균입니다. 그림 6. 흰둥이 C57BL / 6 마우스에 GL261 룩 종양 세포 성장 그래프. Bioluminescence 3 일마다 측정 및 생체내 광자의 개수 비교 일 이후 이식에서와 같이 꾸몄다되었습니다. 사진은 다양한 시간 지점에서 bioluminescence을 보여줍니다. 착색은 종양 세포 번호 (컬러 바가 오른쪽에 표시됩니다)에 상대 bioluminescence의 표시 (픽셀 강도)입니다. 동물이 질병에 굴복 후 머리가 해부되었고 luciferin는 전 생체내의 imag를 얻을 몸에 붙이기도 추가되었습니다E는 삽입 그림에 표시됩니다.