その後の3Dと頭蓋内注入インビボでの生物発光イメージング

1。細胞の文化 GL26細胞株は、がんの治療と診断（DCTD）国立がん研究所（NCI）、メリーランド州フレデリックの部門から入手した。腫瘍の成長率GL261細胞の定量的な測定を容易にするためには、レンティ- X HTパッケージングミックス（クロンテックラボラトリーズ、（株））とFUW -でLentiphos HTシステム（クロンテックラボラトリーズ、（株）、マウンテンビュー、CA）を用いて生物発光行われたプラスミドGL（JBルービン、MD、PhDは研究室からの寛大な贈り物）。細胞は10％テトラサイクリンフリーウシ胎児血清（;クロンテックラボラトリーズ社FCS）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で維持した。 GL261細胞はまた、安定的に指定されたpGL4.51 [luc2 / CMV /ネオ]ベクター（Promega社製、マディソン、WI）とFuGENE 6トランスフェクション試薬（ロシュダイアグノスティックス、インディアナポリス、IN）次の条件を使用してコードする遺伝子luc2でトランスフェクションしたメーカー。 luc2遺伝子は、ホタルluciferaのコドン最適化したバージョンです標準的なルシフェラーゼ遺伝子よりもはるかに高い光出力を提供するSE。安定したトランスフェクタントは、10％FCSおよび100μg/ mlのジェネティシンを（G418、Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）を含むDMEM培地で選択して維持した。 移植前に培養細胞がtrypsinzationによって収穫され、血清を含まないDMEMで一回洗浄し、1 × 10 7細胞/ mlの濃度で血清を含まないDMEMに再懸濁した。 2。手術のセットアップ2 無菌環境はすべての手術器具、用品、手袋、カーテン、等を含む、手術を通して維持される。 十週齢C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr（アルビノC57BL / 6）マウスはフレデリックの家畜生産プログラムで国立がん研究所から購入し、20グラムの平均重量（NCI、メリーランド州フレデリック）で使用されています。 動物は、キシラジン（5 mg / kgの）、ケタミン（50 mg / kgの）およびブプレノルフィン（0.05 mg / kg体重）の腹腔内注射により麻酔する。へのeのピンチは、手術が開始される前に動物が十分に麻酔であることを保証するために行われます。動物のあらゆる部分の動きは（わずかな場合）麻酔のレベルの低下を示すものである。動物はすぐに追加の3.3 mg / kgのキシラジンおよび26.6 mg / kgのケタミンを与えられます。体温は、体を覆うランプと滅菌ドレッシングを使用して維持されます。 動物が適切に麻酔したら、それらは定位ヘッドフレームのクッションベッド（モデル900小動物定位、デビッドKopfはインスツルメンツ）に配置されている[図1]。 アクワの涙眼科潤滑油軟膏の少量（1 / 4インチ）は、角膜の上に適用される。 動物は、動物の口を（動物の顎の周りに人差し指と親指を置くことによって）を開くと定位フレーム内のインデントに前面上部の歯をスライドさせて定位フレームに固定されています。クランプは確実にヘッドセットに動物の頭を保護するために締められていることを目動物の頭部に過度の力を発揮しないようにしてくださいしかし作り、電子のヘッドが整列され、目が中央に配置されます。 O 2ホースは、動物の鼻の穴の近くにダウンテープで固定されています。酸素の流量は0.5リットル/分です。 腰と尾は呼吸を侵害しないように注意しながら定位ベッドにダウンしてテープで固定されています。 外科切開部位を剃毛されています。 Povidine -ヨウ素綿棒のスティックは、ヨウ素は、動物の目に滴下していないことを確認して、ヨウ素と耳の間の領域に戻って、目と目の間の領域を洗浄するために使用されます。 細胞は、ちょうど手術前に移植のために準備されており、定期的に彼らは定住しないように混合される。 10μlのは、50mmの世界の精密機器（WPI）、サラソタ、フロリダ州、26ゲージ斜め針と注射器は、細胞の接種がロードされます。細胞が一緒に凝集していると考えられる場合は、それは注射器を再ロードする必要があるかもしれません。 10μlのシリンジは、UMP3 – 1 UltraMに配置されますicroPumpマイクロインジェクタ（WPI、サラソタ、フロリダ州）。 3。頭蓋内注入2 皮膚切開は、サイズ15メス刃と歯鉗子を使用して行われます。 10〜15ミリメートルの切開はブレグマを（頭蓋骨の上部に矢と冠状縫合の接合部）をさらす動物の耳に向かって移動、縦に動物の目との間で作られています。それは簡単にブレグマ[図2]に遠位である洞エリアと混同される可能性があるため、正しくブレグマを識別してください。 動物を鎮静された後には0.25％（2.5 mg / ml）のブピバカインの内切開注射を受け取ります。 burrholeは徐々に頭蓋骨を貫通され、脳が露出するまで捻りながら、針に少し圧力を加え、16ゲージ1 ½インチの針手をねじることによって正中線の右側にブレグマ後方0.1ミリメートルと2.3ミリメートルをされています。 注射針は、マイクロドライブステレオを使用して所定の位置に下に移動しますreotacticのシリンジホルダーは、それだけで脳の表面に触れるまで。この位置から、針は3 mmの深さに脳に進められ、3分間場所に保管。 針は細胞が注入される小さなポケットを作成し、脳の表面下2.6ミリメートルの合計深さ0.4ミリメートルを引き出される。それは、適切な配置と深さを確保するために動物の針のX線画像を取得するために、この時点ではオプションです。 細胞懸濁液を667 NL /分の注入速度で2000 NL（2μL）の音量に設定されてマイクロインジェクターを使用して3分間にわたって注入される。 針は点滴の部位からの漏れを防ぐために、2分間そのまま残されている。 針は、徐々に完全に引き出される。 burrholeは、ペンフィールドのディセクタを使用して骨ワックスで満たされている。 切開はない、大きなギャップが皮膚に残っていないことを確認して4-0（1.5メートル）vicryl縫合糸を用いて縫合する。 Vicrylは溶解縫合材料です。のため、縫合糸は、切開が治癒されたときに削除する必要はありません。 手術後、動物を30にケージの底部表面を温めるのに必要な高さに設定されている加熱ランプ℃の下にケージに入れている動物は完全に目覚めているとき（のようなケージで通常の動きで判断）、それらは集合住宅に返されます。経口イブプロフェンは、術後5日間、飲料水に追加されます。子供のイブプロフェン（100mg/5ml）の100mgを標準473ミリリットルの齧歯類の水のボトルに追加されます。動物を毎日観察し、画像化し、3日ごとに秤量する。二週間後胚の観察は1日2回に増加しています。彼らは猫背の姿勢を含む健康の衰えの兆し、不自由と目に見える体重減少（≥20％）を示すとき、動物は安楽死させる。これらの症状は、腫瘍に公開されて応答であり、彼らは再現性の前腫瘍による死亡まで約1日が表示されます。 （4）in vivoで </EM>生物発光イメージング3 [リビングの画像]ソフトウェアを起動します。 IVISイメージングシステムは、[初期化IVISシステム]コントロールパネルの右側下部にあるボタンをクリックすることによって初期化されます。 コントロールパネルの上部左側にある[発光]イメージングモードを選択します。 ルシフェリンの投与後に動力学的研究が必要な画像処理の最適な時期を判断するには[図3]。この説明では、ホタルルシフェラーゼ用です。 後述するように、動物に、D -ルシフェリンホタル（キャリパーライフサイエンスカタログXR – 1001または他のベンダーから同様の製品のPBS中15mg/ml）の10μlの/ g体重を注入する。 3分待ってから、ガス麻酔室（O 2中2％イソフルランガス）に置いて、マウスを麻酔。 チャンバーにガス麻酔をオフにして、IVISのマニホールドに麻酔のバルブと真空を開きます。すぐに鎮静動物を配置温度の上でマウスの鼻孔が適切にガス麻酔のマニホールドに配置されていることを確認し、イメージングプラットフォームを制御する。最初の画像は、約5分ルシフェリンの注入後に撮影する必要があります。最大5匹の動物にIVISスペクトラム測定器で一度に撮像することができます。以下の5匹の動物が撮像される場合、それはイソフルランガスを節約するために、未使用のマニホールド（s）をプラグインすることが可能です。 ルシフェリンの発現のための運動曲線を生成するまでの時間のためのシーケンスを作成することにより、3分ごとに画像を撮影し続ける。 コントロールパネルで[シーケンスの設定]ボタンをクリックします。 シーケンスエディタが表示されます。 コントロールパネルで、シーケンスの最初の生物発光画像の設定を指定します。 我々はミディアムビニングから始めることをお勧めします。 我々はまた、最適な露光時間を決定するために自動露出をお勧めします。 シーケンスエディタの[遅延]ボタンを選択するndはそれぞれの買収の間に3分の遅延時間を指定します。 シーケンスエディタで[追加]をクリックします。買収のパラメータは、テーブルに追加されます。 シーケンスの各イメージに対して手順4を繰り返します。 曲線が確立されると、最適な撮影時間は、信号強度（強度）対時間をプロットすることにより決定することができます。 生体光子の最高時の画像の動物は、最強かつ最も正確な信号を得るために数える。 ルシフェリンの腹腔内（ip）注射を使用した初期の実験では、しかしながら、IP注射は時折腫瘍のない生物にはほとんど示して断続的な結果をもたらした。我々は、信号の時折ランダムな欠如が腸や他の臓器へのルシフェリンの配信によるものであるという仮説を立てた。そこで、皮下（sc）ルシフェリン注射を使用するようになったし、より大きな画像の再現性を見た[図3]。 20皮下注射後の分は、動物は、彼らが応答しなくなるまで、O 2中2％イソフルランガスをチャンバ内に配置することで麻酔する。 麻酔動物（s）は、イメージング室に移動されます。眼軟膏が原因画像の長さの動力学的研究に使用する必要があります。彼らは持続時間が短くなるので、それは他のイメージングの手順は必要ありません。 画像は5分の露光時間で培地ビンで取得されます。自動取得のオプションを使用することもできます。 信号が飽和および/または培地ビニングで気絶している場合、ビニングまたは露光時間を調整することができます。 プログラムファイルとそれに続く画像のコメントは、ユーザーのコンピュータのディレクトリに保存されます。 5。 3Dイメージング3 コントロールパネルの[シーケンスの設定]ウィンドウで、[イメージ作成ウィザード]タブをクリックします。 イメージ作成ウィザードの開始画面とCLで[生物発光]イメージングモードを選択する嫌なもの[次へ]。 "生物発光 – DLIT"でイメージ作成ウィザードのウィンドウ、[ホタル]レポータープローブを選択します。選択されたホタルの震源スペクトルの発光/励起は買収される6つの対応するフィルタを選択して表示されます。 最後の画面は、自動露出の取得パラメータとビューC.のデフォルト設定のフィールドの非常にうまく動作を含むデフォルトの選択肢で表示されます。必要に応じしかし、これらの設定を変更することができます。 [次へ]をクリックし、シーケンスエディタウィンドウは、20nmの広いフィルタ（560nmの、580nmの、600nmの、620 nmで、640 nm、および660nmの）6つのスペクトル領域の配列が入力されます。押して、[シーケンスを取得]。最初のフィルタ（560 nm）は、表面の地形を確立するためにレーザー検流計を用いて構造化された光のパターンが含まれます。 ツールパレットで[の表面形状]タブを選択します。表面の平滑化は、再構築プロセス中に作成されたすべての鋭角のためにアカウントに適用することができます。市販デフォルト低い平滑化することをお勧めします。 [作成]をクリックしますとトモグラフィー解析ダイアログボックスが表示されます。全体動物を含むし、[次へ]をクリックしますクロップボックスを描画します。 閾値ツールは、選択した領域の上に紫のマスクとして表示されます。マスクは自動的に動物の写真と一致するように設定する必要があります。必要に応じて、より適切に動物の輪郭に合わせてマスクのしきい値を調整します。 をクリックして[完了]と再建されたメッシュが表示されます。再建は、その後の結果]タブに保存することができます。 動物の表面形状の作成に続いて、[DLIT三次元再構成]に進んでツールパレットのドロップダウン。 [分析]タブの下で再建を実行するすべての6つの波長を選択します。 600の下に飽和ピクセルまたはカウントをもたらしたの選択を解除します画像。デフォルトとして[パラメータ]タブで設定しておきます。 [プロパティ]タブの下に、"筋肉"がデフォルトの選択肢として表示されますRの組織特性、そして"ホタル"は震源スペクトルとして表示されます。 クリック分析]タブの下に[再構築]を、そして動物の表面と信号源の対応する復元の3D再構成は、[4図]に表示されます。 信号の位置と強度を決定するために、ツールパレットの3Dツール]タブのボクセルボタンを選択します。 表示されているすべてのボクセルの周りの正方形を描き、全光束の測定は、ボリュームのタブの下部に表示されます。 [重心]をクリックして選択されたボクセルの信号の位置を特定する。動物の冠状、矢状及び横断スライスが表示され、[測定カーソルの表示]を使用されるボクセルの中心に動物の表面からの距離を測定することができます。 臓器の地図帳や他の高度な機能の共同登録の詳細については、リビングイメージソフトウェアのユーザーズマニュアルを参照してください。 6。データnalysis 3 画像が取得して保存したら、[参照]ボタンをクリックしてファイルを選択することにより、プログラムファイルにアクセスします。 画像情報は、[表示]の下で見つけることができます→[画像情報]。 信号の強度は、利息（ROI）[RO​​Iツール]ボタンの領域を選択することによって定量することができる。画像はイメージコントロールパネルの左上隅のドロップダウンリストで"フォトン"を選択して[フォトン]モードで解析されていることを確認します。 "タイプ"ドロップダウンリストから[測定ROI]ボタンを選択します。興味のROI形状を選択し、オプションはサークル、広場、およびまたはグリッドが含まれています。取得した画像上の輝度の全領域​​をカバーしています。 ROIの位置は、生物発光シグナルを含む領域にROIの形状の選択をドラッグして設定されています。 ROIの信号強度は、[測定]ボタンをクリックすることによって計算されます。 ROIのラベルは、強度が表示されます。 ROIのは、管理され、USIを保存することができます。ngの生活Imageソフトウェア。 7。代表的な結果： 成功した細胞移植は、移植細胞は、手術の日にIVISのスペクトルを用いて検出可能であるときに明らかです。 GL261 – lucおよびGL261 – luc2細胞の両方が検出可能である、しかし、luc2遺伝子は、生物発光のより高いレベルの[図5]を提供します。すぐに注入した後、撮影した画像は、背景として無視されるべき動物の足と鼻の上に非特異的なシグナルを持つことができます。着床のサイトにある信号は実数で、信号は時間[図6]に増加します。 6日目の信号強度の低下は、再現性と移植細胞の一部がかかる腫瘍の消失に起因する可能性が最も高いです。腫瘍負荷の定量的測定は、動物が最終的に病気にsuccumbsまで、彼らは着実に増加することで再現可能です。しかし、成長曲線は、大部分は移植細胞の状態、およびまたはやむを得ないマイナーVARに依存します。移植手順でiability。当研究室では、3日ごとに画像を移植動物に選出された。 マウスが適切に麻酔した後、図1。、それは定位フレームに配置されます。マウスの頭部は、口のクランプを使用して保護されています。 図2。スキンはメインの解剖学的ランドマークがブレグマ、冠状および矢状縫合を含むを含む識別される開かれた後。 burrholeは、頭蓋骨を貫通され、脳が露出するまでゆっくりと圧力の少量で16ゲージ1 ½インチの針をねじることによってブレグマの右に2.3ミリメートルになります。 図3。皮下の運動の比較（iles/ftp_upload/3403/3403fig3_1.jpg"ALT ="Figure3.1"/>）に対する腹腔内（ ）ルシフェリンの注射は、皮下ルシフェリンの注射の有用性を実証するために、イメージは、次ルシフェリンの投与に最適な時間を識別するために実施した。ルシフェリンを注入した3分後にマウスは、鎮静IVISスペクトラム楽器に配置され、時間と生物発光の運動曲線を生成するために、その後6分ごとに、最大のために3分ごとに画像化した。これは、ルシフェリン投与の皮下経路は我々の手で腹腔内注射に優れていた、とのイメージに最適な時間という動物がGL261 – lucの細胞が使用されたルシフェリン注射後約25分であることを示した。 図4 3次元reconstの複数のビューGL261 – luc2細胞の頭蓋内移植の騒動は、マウスの骨格と脳との共同登録。 図5。GL261 – lucのセルVS GL261 – luc2細胞から生じる腫瘍から得られたフォトンカウント。結果は5匹の動物の平均です。 図6。アルビノC57BL / 6マウスにおけるGL261 – lucの腫瘍細胞の成長のグラフ。生物発光は3日ごとに測定し、 生体フォトンの数対日着床後のようにプロットした。写真は、種々の時点で生物発光を示す。着色は、腫瘍細胞数（カラーバーが右側に表示されている）からの相対的な生物発光の表示（画素強度）です。動物が病気に倒れた後に脳を解剖したとルシフェリンは、ex vivoでの音像を得るために局所的に追加されましたeが挿入図に示す。