באמצעות גנטיקה הפוכה כדי לתפעל את ג'ין NSS של וירוס קדחת עמק השבר MP-12 מסננים כדי לשפר את בטיחות חיסון והיעילות
Summary
מערכת גנטיקה הפוכה עבור זן בקעת נגיף קדחת-12 MP החיסון הוא כלי שימושי ליצירת נוספים MP-12 מוטנטים עם הנחתה מוגברת immunogenicity. אנו מתארים את הפרוטוקול כדי לייצר ולאפיין שמוטציות NSS.
Abstract
בקעת חום וירוס (RVFV), מה שגורם קדחת מדממת, הפרעות נוירולוגיות או לעיוורון אצל בני אדם, שיעור ההפלות גבוה למום עוברי מעלי גירה 1, סווגה HHS / USDA חפיפה סוכן לבחור קבוצת סיכון 3 הפתוגן. היא שייכת Phlebovirus הסוג של Bunyaviridae המשפחה הוא אחד מחברי ארסית ביותר של משפחה זו. מספר מערכות גנטיקה הפוכה עבור זן MP-12 חיסון RVFV 2,3 וכן wild-type זנים RVFV 4-6, כולל ZH548 ו ZH501, פותחו מאז 2006. המתח-12 מגה פיקסל (שהיא קבוצת סיכון 2 הפתוגן ואת סוכן לא לבחור) הוא נחלש מאוד על ידי מוטציות במספר שלה-M ו-L-מגזרים, אך עדיין נושאת ארסית S-RNA קטע 3, אשר מקודד ארסיות תפקודית , גורם NSS. RMP12-C13type (C13type) נושאת 69% ב-מסגרת מחיקה של NSS ORF חסר כל הפונקציות NSS ידוע, ואילו זה משכפל effic כמוient כפי שעושה MP-12 VeroE6 תאים חסר סוג אני IFN. NSS משרה כיבוי שעתוק של המארח כולל אינטרפרון (IFN)-beta-mRNA 7,8 ומקדם השפלה של קינאז RNA תלויי פעמיים תקועים חלבון (PKR) ברמה שלאחר translational. 9,10 IFN-beta הוא transcriptionally שהוגברו על ידי גורם אינטרפרון רגולטוריות 3 (IRF-3), NF-kB ו activator חלבון-1 (AP-1), ואת הקישור של IFN-ביתא IFN-alpha/beta קולטן (IFNAR) מגרה את שעתוק של IFN-alpha גנים או גנים אינטרפרון גירה אחרים (ISGs) 11, אשר גורם לפעילות אנטי המארח, ואילו תעתיק מארח כולל דיכוי גנים IFN-ביתא על ידי NSS מונע upregulations הגן של ISGs אלה בתגובה שכפול נגיפי למרות IRF-3, NF-kB ו activator חלבון-1 (AP-1) יכול להיות מופעל על ידי RVFV7. . לפיכך, NSS היא יעד מצוין נוסף להחליש MP-12, כדי לשפר את התגובה החיסונית המולדת מארח ידי ביטול פונקציית IFN-beta דיכוי. כאןאנו מתארים פרוטוקול להפקת רקומביננטי MP-12-NSS קידוד מוטציה, ולספק דוגמה של שיטת ההקרנה לזהות מוטציות NSS חסרה הפונקציה לדכא IFN-beta סינתזת mRNA. בנוסף תפקיד חיוני שלה חסינות מולדת, סוג אני IFN חשוב ההבשלה של תאים דנדריטים ואת אינדוקציה של תגובה חיסונית אדפטיבית 12-14. לפיכך, NSS גרימת מוטציות מסוג אני IFN הם נחלש עוד יותר, אבל באותו זמן הם יעילים יותר בתגובות המערכת החיסונית מארח מגרה מאשר wild-type MP-12, מה שהופך אותם למועמדים אידיאליים עבור גישות החיסון.
Protocol
Discussion
הפוך גנטיקה מערכות RVFV פותחו על ידי מספר קבוצות על ידי ניצול האמרגן T7 2,4,5 או עכבר 3 או 4 pol האדם, אני מקדם. בכתב היד הזה, אנו מתארים פרוטוקול ליצור רקומביננטי MP-12 RVFV זנים באמצעות BHK/T7-9 תאים 15 כי פולימראז ביציבות להביע T7-RNA. את היעילות של התאוששות ויראל…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי מספר גרנט 5 U54 AI057156-07 באמצעות המרכז האזורי המערבי של אקסלנס (WRCE), 1 R01 AI08764301-A1 מ – המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, וכן מימון פנימית מהמרכז Sealy לפיתוח חיסון באוניברסיטת סניף טקסס רפואי.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Minimum Essential Medium (MEM)-alpha | Invitrogen | 32561037 | |
| Dulbecco’s modified minimum essential medium | Invitrogen | 11965092 | |
| Modified Eagle Medium (MEM 2x) | Invitrogen | 11935046 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Hygromycin B | Cellgro | 30-240-CR | |
| Tryptose phosphate broth | MP biomedicals | 1682149 | |
| Noble agar | VWR | 101170-362 | |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | |
| Aerosol tight lid | Eppendorf | C-2223-25 | |
| 0.33% neutral red solution | Sigma Aldrich | N2889-100ML | |
| C57/WT MEF cells | InvivoGen | mef-c57wt | |
| Blasticidin S | InvivoGen | Ant-bl-1 | |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | |
| BHK/T7-9 cells15 | Gifu university, Japan | ||
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
Referências
- Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. Rift Valley fever virus. J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
- Billecocq, A. RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses. Virology. 378, 377-384 (2008).
- Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus. J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).
- Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection. Virology. 359, 459-465 (2007).
- Billecocq, A. NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription. J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).
- May, N. L. e. TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
- Ikegami, T. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).
- Habjan, M. NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).
- Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente. Science. 312, 879-882 (2006).
- Bon, A. L. e. Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo. Immunity. 14, 461-470 (2001).
- Le Bon, A., Tough, D. F. Links between innate and adaptive immunity via type I interferon. Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).
- Tough, D. F. Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation. Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).
- Ito, N. Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system. Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).
- Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
- Diaz, M. O. Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).
- Constantinescu, S. N. Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).
- Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor. EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).
- Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology. 170, 505-510 (1989).
- Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression. J. Virol. 62, 826-833 (1988).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Muller, R. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).
- Le May, N. A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells. PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).
- Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
- Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. IRF family of transcription factors as regulators of host defense. Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).
- Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7. EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment. J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).
- Mims, C. A. Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection. Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).
- Bouloy, M. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).
- Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease. Virology. 362, 10-15 (2007).
