Usando genética reversa para manipular o NSS Gene do vírus da febre Rift Valley MP-12 Strain para melhorar a segurança e eficácia da vacina
Summary
O sistema de genética reversa para o vírus da febre Rift Vale cepa vacinal MP-12 é uma ferramenta útil para a criação de adicionais MP-12 mutantes com atenuação aumentada e imunogenicidade. Nós descrevemos o protocolo para gerar e caracterizar NSS cepas mutantes.
Abstract
Vírus da febre Rift Valley (RVFV), que causa febre hemorrágica, distúrbios neurológicos ou cegueira em humanos, e uma alta taxa de aborto e malformação fetal em ruminantes 1, foi classificado como um HHS / USDA sobreposição agente selecionado e um grupo de risco 3 patógeno. Pertence à Phlebovírus gênero no Bunyaviridae família e é um dos membros mais virulenta dessa família. Vários sistemas de genética reversa para a cepa vacinal MP-12 RVFV 2,3, bem como cepas do tipo selvagem RVFV 4-6, incluindo ZH548 e ZH501, têm sido desenvolvidos desde 2006. O MP-12 estirpe (que é um grupo de risco 2 patógeno e um agente não-select) é altamente atenuada por várias mutações em seu M e L-segmentos, mas ainda carrega virulenta segmento S-RNA 3, que codifica uma virulência funcional NSS fator. O rMP12-C13type (C13type) transportando 69% em-frame de eliminação do NSS ORF não tem todas as funções NSS conhecida, enquanto ele replica como effictário como faz MP-12 em células VeroE6 faltando tipo I IFN. NSS induz um shut-off de transcrição de hospedeiros, incluindo interferon (IFN)-beta mRNA 7,8 e promove a degradação de double-stranded RNA-proteína quinase dependente (PKR) em nível de pós-translacionais. 9,10 IFN-beta é transcricionalmente upregulated por interferon fator de regulação 3 (IRF-3), NF-kB e proteína ativadora-1 (AP-1), ea ligação do IFN-beta para IFN-alpha/beta receptor (IFNAR) estimula a transcrição de IFN-alpha genes ou de outros genes interferon estimulada (ISGs) 11, que induz actividades de acolhimento antiviral, ao passo que a supressão anfitrião de transcrição incluindo IFN-beta gene pela NSS impede que o gene upregulations daqueles ISGs em resposta a replicação viral, embora IRF-3, NF-kB e ativador proteína-1 (AP-1) pode ser ativado por RVFV7. . Assim, o NSS é um excelente alvo para continuar a atenuar MP-12, e para melhorar a resposta imune inata anfitrião, abolindo a função de supressão de IFN-beta. Aqui, Nós descrevemos um protocolo para a geração de um recombinante MP-12 NSS codificação mutado, e fornecer um exemplo de um método de triagem para identificar mutantes NSS falta a função de suprimir a síntese de IFN-beta mRNA. Além de seu papel essencial na imunidade inata, tipo I IFN é importante para a maturação das células dendríticas e indução de uma resposta imune adaptativa 12-14. Assim, os mutantes NSS induzindo tipo I IFN são mais atenuadas, mas ao mesmo tempo, são mais eficientes na resposta do hospedeiro estimulante imunológico do tipo selvagem MP-12, o que os torna candidatos ideais para abordagens de vacinação.
Protocol
Discussion
Genética reversa de sistemas para RVFV foram desenvolvidos por vários grupos, utilizando T7 promoter 2,4,5 ou mouse de 3 ou 4 humanos promotor pol-I. Neste manuscrito, nós descrevemos um protocolo para gerar recombinantes RVFV MP-12 linhagens de células usando BHK/T7-9 15 que expressa estavelmente T7 RNA polimerase. A eficiência de recuperação viral variava de acordo com a condição de BHK/T7-9 células, a quantidade de plasmídeos, o número de células transfectadas …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Grant Number 5 U54 AI057156-07 através do Centro Regional de Excelência Ocidental (WRCE), um R01 AI08764301-A1 do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, e um financiamento interno do Sealy Center for Vaccine Development da Universidade de Texas Medical Branch.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Minimum Essential Medium (MEM)-alpha | Invitrogen | 32561037 | |
| Dulbecco’s modified minimum essential medium | Invitrogen | 11965092 | |
| Modified Eagle Medium (MEM 2x) | Invitrogen | 11935046 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Hygromycin B | Cellgro | 30-240-CR | |
| Tryptose phosphate broth | MP biomedicals | 1682149 | |
| Noble agar | VWR | 101170-362 | |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | |
| Aerosol tight lid | Eppendorf | C-2223-25 | |
| 0.33% neutral red solution | Sigma Aldrich | N2889-100ML | |
| C57/WT MEF cells | InvivoGen | mef-c57wt | |
| Blasticidin S | InvivoGen | Ant-bl-1 | |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | |
| BHK/T7-9 cells15 | Gifu university, Japan | ||
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
Referências
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