Seguindo o destino celular, em<em> E. coli</em> Após a infecção por um fago Lambda

1. Criação de um lisado de fago em bruto (fig. 1) Num balão de 50 ml, inocular uma colónia fresca de LE392 (λ LZ1) [pPLate * D] (ver Tabela 1 para detalhes) em 6 ml de meio LB suplementado com 10 7 ug / ml e canamicina 100 ng / ml de ampicilina. Crescer durante a noite a 30 ° C com agitação suave (180 rpm). Diluiu-se a 1:100 em cultura LBM (LB suplementado com 10 mM de MgSO 4) e crescer a 30 ° C com agitação suave (180 rpm). A fim de optimizar o rendimento de fago, certifique-se de que o volume de cultura não é mais do que um décimo da capacidade de volume do frasco. Nós normalmente preparar dois frascos de capacidade de 2 litros ou 2,5 litros, e adicionar 2,5 ml da cultura durante a noite em 250 ml de meio de LBM em cada frasco. Quando a densidade celular atinge OD 600 ≈ 0,6 (~ 2,5-3 hr), induzem a lisogénio movendo a cultura a 42 ° C de um banho de água em agitador durante 18 min com agitação suave (180 rpm) e, em seguida incubate a 37 ° C com agitação suave (180 rpm) até que a lise é visível (cultura torna-se claro, em ~ 60 – 90 min). Adicionar clorofórmio a 2% para a cultura, agitar para misturar à mão, e, em seguida, incubadas durante 15 min à temperatura ambiente. Cuidado: Use luvas para lidar com clorofórmio, e evitar respirar ele. Transferir a cultura em dois frascos de centrífuga de 250 ml, centrifugar a cultura num rotor Sorvall GSA a 10000 rpm durante 15 min a 4 ° C. Recuperar o sobrenadante que contém as partículas de fago, e descartar o pellet de detritos. Realizar uma segunda centrifugação para se certificar de se livrar dos restos visíveis. Usar um protocolo padrão de titulação de fagos 8 para medir a concentração de fagos. O título do fago deve ser ~ 5-10 x 10 9 pfu / ml. Utilizar uma estirpe supF, tais como a estirpe LE392 como indicador, devido à mutação SAM7 no genótipo do fago fluorescente, e usar agar de topo e placas de agar feitas com NZYM rica para se obter placas maiores (Figura 2). 2. Purificação de fagos (Figura 1) Verter o lisado para um balão (por exemplo, de 2 litros) grande, adicionar DNase I e RNase (1 ug / ml de cada) com o lisado, a fim de digerir os ácidos nucleicos libertados a partir de bactérias lisadas, e incubar 1 hora à temperatura ambiente. Adicionar NaCl 1M ao lisado, transferir o lisado para frascos de centrífuga de 250 ml, e incuba-se 3 horas em gelo. Centrifuga-se o lisado numa Sorvall GSA a 10000 rpm durante 15 min a 4 ° C. Recuperar o sobrenadante. O título do fago deve ser semelhante à do lisado em bruto, que é de aproximadamente 5-10 x 10 9 pfu / ml. A adição de NaCl promove a dissociação das partículas de fago a partir de resíduos bacterianos e é requerido para a precipitação de partículas de fago eficiente por PEG 8. Verter o lisado para um balão de grande porte, por exemplo, de 2 litros frasco, adicionar 10% (w / v) de PEG8000 para o lisado, lentamente agitar ou agitar para dissolver PEG8000 à temperatura ambiente. Transferir o lisado em 250 ml centorifuge garrafas e depois incubar durante a noite (~ 16 horas) a 4 ° C. Centrifugar o lisado num rotor Sorvall GSA a 10000 rpm durante 15 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante. Embeber o sedimento (partículas de fago precipitado com PEG8000) com fago tampão SM (4 ml de tampão SM por 250 ml de lisado de fagos inicial). Incubar com agitação muito suave ou sem agitação durante 16 horas a 4 ° C. Suavemente retire o lisado (tampão SM com as partículas de fago) para um tubo de centrífuga de 50 ml de Eppendorf e, em seguida lavar o sedimento restante com 0,5 – 1 ml de tampão SM. Adicionar um volume igual de clorofórmio ao lisado. Misture delicadamente o lisado com clorofórmio até invertendo e para baixo por algumas vezes. Centrifugar a 4000 rpm durante 15 min a 4 ° C num Eppendorf 5804R ou uma centrífuga de bancada similar. Repita o passo 2.6 para obter uma melhor lisado. O título do fago deve ser ~ 1-2 x 10 11 pfu / ml. Prepare SM / CsCl soluções com três densidades diferentes (ρ) de 1,3 g / ml, 10,5 g / ml e 1,7 g / ml. Medir o índice de refracção (η) para obter uma leitura mais precisa da densidade. A conversão densidade 9 é ρ = 10,8601 η – 13,4974, a 25 ° C. Consulte a Tabela 3 para detalhes. Use uma seringa com uma agulha de tempo para carregar a solução para um ultra-claro 14 ml Beckman 40Ti tubo de ultracentrifugação. Para evitar a mistura e formar um gradiente de densidade melhor, underlaying a solução (isto é, soluções de camadas de densidade crescente sob um outro) deve ser utilizado, ou seja, suavemente transferida 2 ml de SM / CsCl soluções na ordem de 1,3 g / ml, 1,5 g / ml e 1,7 g / ml, por inserção da agulha de uma seringa de 3 ml para a parte inferior do tubo. Suavemente carregar 8 ml de lisado de fagos através da sobreposição da parte superior do tubo de ultracentrifugação de 14 ml. Preparar um tubo de equilíbrio. Centrifugar numa SW40Ti rotor Beckman a 24.000 rpm durante 4 horas a 4 ° C. Suavemente retirar o tubo num quarto escuro e iluminar a partir do topo do tubo contra um fundo negro com aflashlight. A banda do fago deve ser claramente visível no local da interface entre 1,3 g / ml e 1,5 g / ml de SM / CsCl camadas (Figura 3A). Punção através da parede do tubo ligeiramente abaixo da banda com uma agulha de calibre 21,5 com uma seringa de 3 ml. Recolher suavemente ~ 500 uL da suspensão de fagos. O título do fago deve ser ~ 5-10 x 10 11 pfu / ml. Colocar a suspensão de fagos a 4 em ultra-claro ultracentrífuga Beckman ml tubo SW60Ti rotor. Encher o tubo com 1,5 g / ml de SM / solução de CsCl. Preparar um tubo de equilíbrio. Centrifugar numa SW60Ti rotor Beckman a 35.000 rpm durante 24 horas a 4 ° C. Repetir o mesmo procedimento como no passo 2.11 a recolher o fago a partir da banda visível. A banda deve ser visível como mostrado na Figura 3B. Carregue a suspensão de fagos a uma cassete de membrana de diálise (Tabela 2) e dializar três vezes contra um volume 1000 vezes superior de tampão SM a 4 ° C durante períodos de tempo de 3 horas, 3 horas e overnight (~ 16 horas). O objetivo da diálise é livrar-se de presente CsCl na suspensão de fagos. O título de fagos final deve ser ~ 5-10 x 10 11 pfu / ml. 3. Preparar uma placa de gel de agarose (Figura 4) Limpar seis lâminas de microscópio (75 x 50 mm, 1 mm de espessura) com etanol a 70%. Dispor as lâminas 5 e fixá-lo com fita adesiva, como mostrado na Figura 4. Misturar 0,09 g de agarose em 6 ml de meio num copo pequeno coberto com filme plástico (produzindo agarose 1,5%). Aqueça em uma chapa quente até que a solução se torne clara. Despeje a solução de agarose para os slides garantidos. Coloque o último slide no topo, evitando cuidadosamente as bolhas de ar. Coloque o peso em cima e deixe arrefecer durante ~ 30 min. Remover os quatro lâminas do lado, e envolva a laje em conjunto com as lâminas superior e inferior com filme plástico. A laje pode ser armazenado a 4 ° C durante até 3 dias. 4. Testando o stock de fagos purificados Prepararuma laje de gel PBS-agarose como descrito acima (secção 3). Manchar o fago purificado com DAPI. Misturar 10 ul de fagos (~ 1 x 10 10 pfu / ml) com 10 ul de 10 ug / ml DAPI (DAPI concentração final de 5 ug / ml), incubar durante 30 min a 4 ° C ou 10 minutos a temperatura ambiente. Ul lugar 1 da mistura de fagos / DAPI no centro de uma No.1 24 x 50 mm lamela, sobreposição de um pedaço pequeno (~ 10 x 10 mm) da pré-preparados laje PBS-agarose. O pequeno pedaço de laje de agarose é cortado com uma lâmina de barbear após o deslizamento de topo sobre o gel de sanduíche é removido. Imagem da amostra sob o microscópio de epifluorescência, através dos canais de YFP e DAPI. Fagos individuais, deverá ser visível como difracção limitada fluorescentes "spots" em ambos os canais (Figura 5). Use o mesmo microscópio e configurações da câmera como no Passo 6.2. 5. Infecção (Figura 6) Num tubo Falcon 14 ml, inocular uma colónia fresca de LE392 [pP RE-MCHerry] (ver Tabela 1 para detalhes) em 2 ml de meio LB suplementado com 100 ug / ml de ampicilina, 10 mM de MgSO 4 e 0,2% de maltose. Crescer durante a noite a 37 ° C com agitação moderada (265 rpm). Diluiu-se a 1:1000 em cultura LBMM (LB suplementado com 10 mM de MgSO 4 e 0,2% de maltose), ou seja, adicionam-se 5 ul da cultura durante a noite em 5 ml de meio LBMM em um frasco de 50 ml. Crescer a OD 600 ≈ 0,4 a 37 ° C com agitação moderada (265 rpm). Use médio LBM para preparar uma laje gel LBM-agarose como descrito na Seção 3 acima. Centrifugar 1 ml de células a 2.000 g numa microcentrifuga de bancada durante 2 minutos à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e ressuspender as células suavemente em 20 LBMM gelada ul para chegar a OD 600 & 20. Ao manipular o stock de fagos purificados, utilizar uma pipeta de ponta larga ou cortar a ponta da pipeta regular para fazer a ponta de abertura mais amplo, a fim de evitar que as partículas de fagos corte 3. Gentilmente Mix 20 ul de células com 20 ul de fago purificado para atingir uma razão de fagos-a-célula médio na gama de 0,1 – 5. Incubar em gelo durante 30 min para permitir a adsorção do fago e depois incubar em banho de água a 35 ° C durante 5 min para desencadear o fago de DNA de injecção 6. Pipetar cima e para baixo algumas vezes para separar qualquer agregados celulares. Novamente utilizar uma ponta de pipeta de largura de corte para evitar os fagos. Dilui-se a mistura em LBMM 01:10, por exemplo, mistura de 5 ul em 45 LBMM ul. Coloque um pedaço de LBM-agarose laje (~ 10 x 10 mm) sobre uma lamela de 22 x 22 mm No.1. O pré-preparados laje LBM-agarose deve ser colocada à temperatura ambiente durante pelo menos 1 hora antes de ser utilizado para garantir que a laje de agarose atingir a temperatura ambiente. Ul lugar 1 da mistura de fagos / células na laje de agarose e aguardar 1 minuto para permitir que a mistura de absorver na laje de agarose. Suavemente coloque uma lamela No. 1 24 x 50 mm na parte superior da laje de agarose. Este procedimento destina-se a evitar o corte os fagos a partir da infected célula (Figura 6). 6. Seguindo o destino das células ao microscópio Monte cuidadosamente a lamela na fase do microscópio. Para imagiologia, utilize uma objectiva de grande ampliação (por exemplo, 100x) (ver sistema de microscópio em discussão abaixo). Adquira uma imagem definida para o período de tempo inicial. Este conjunto de imagem será utilizada para caracterizar os números iniciais e as posições de todos os fagos que infectam. Tomar uma série de 15 imagens em 200 nm eixo Z (vertical) intervalos. Imagem através do canal de YFP. Além disso, o exame de uma imagem em foco único através do contraste de fase e canais mCherry. Optimizar a intensidade da luz e do tempo de exposição para obter um sinal suficientemente minimizando branqueamento e dano celular (ver Aquisição de Imagem em discussão abaixo). Adquirir um filme de lapso de tempo do destino da célula pós-infecção. Imagem da amostra em contraste de fase, YFP e mCherrycanais a intervalos de tempo de 10 min a cerca de 4 horas. Durante o filme de lapso de tempo, utilizar uma imagem z posição única por canal por ponto de tempo, a fim de evitar a exposição desnecessária da amostra, o que poderia levar à descoloração e fototoxicidade. 7. A análise de imagem Manualmente contar o número de fagos e localização recorde de fago e o comprimento das células no espaço de tempo inicial. Isso pode ser feito usando o software como MetaMorph ou ImageJ. Anote os destinos celulares (lítico, lisogênico ou não infectados), tempo de lise, e qualquer outra informação desejada por reproduzir o filme de lapso de tempo. Para identificar destinos diferentes de células, consulte Time-lapse do filme na seção Resultados Representante abaixo. Para além da análise manual acima, mais dados quantitativos (por exemplo, nível de fluorescência ao longo do tempo nas células individuais) pode ser extraído utilizando automatizados célula de reconhecimento e linhagem algoritmos de rastreamento. Nós usamos uma casa construída programa Matlab para tracing a linhagem de célula e os níveis de fluorescência, em conjunto com o código Matlab Schnitzcell para a segmentação das células (escrito por grupo Elowitz Caltech). 8. Os resultados representativos: Chapeamento Phage: As placas dos fagos marcadas com fluorescência (em 1,6 passo e Seção 2) são significativamente menores que os do tipo selvagem (Figura 2). Por conseguinte, incubar as placas pelo menos durante 12 horas em 37 ° C para as placas da incubadora a ser visível. Ultracentrifugação Phage: Após ultracentrifugação a amostra de fago com o gradiente de CsCl passo (Passo 2.10), duas bandas devem ser visíveis (Figura 3A). A banda superior, na interface entre a suspensão de fagos e SM / CsCl 1,3 camada g / ml, contém fragmentos de células e de fagos cápsides vazias. A banda inferior, na interface entre 1,3 g SM / CsCl / ml e 1,5 g / ml de camadas, é a banda do fago. Thibanda s aparece esverdeado fluorescente para o fago λ LZ2. A banda de tipo selvagem fago λ IG2903 aparece azulada 5. Após a ultracentrifugação de gradiente de equilíbrio de CsCl na Etapa 2.12, uma banda do fago deve ser visível na parte do meio do tubo (Figura 3B). Uma vez que o fago λ LZ2 fluorescente contém uma mistura de gpD-EYFP e cãpsides gpD, a proporção de proteína para o DNA é maior do que o de tipo selvagem. Por conseguinte, a banda do fago λ LZ2 fluorescente é um pouco mais leve (parece estar em uma posição mais elevada dentro do tubo) que o de tipo selvagem λ IG290310. A coloração DAPI: A Figura 5 apresenta imagens típicas obtidos após a rotulagem do fago com DAPI (Seção 4). Os sinais YFP e DAPI de um fago com sucesso purificada deve ter cerca de 100% a correspondência. Nós normalmente observam que menos de 1% da mancha YFPs não contêm DAPI (representando cãpsides sem o genoma viral). Menos de 1% dos locais DAPI não contêm YFP (correspondente a não fluorescentes fagos) 5. Lapso de tempo do filme: Células líticos são reconhecidos pela acumulação de YFP fluorescência (canal verde) no interior da célula, seguida de lise celular. Células lisogénica são reconhecidos pela acumulação de fluorescência uniforme mCherry (vermelho) no interior da célula e a retoma do crescimento de células normais e de divisão. As células não infectadas (ou células em que a infecção tenha falhado) não apresenta qualquer dos fenótipos acima e vai crescer e dividir-se normalmente. Figura 7 mostra algumas imagens-conjuntos de contraste de fase, YFP e canais mCherry, e as imagens correspondentes sobrepostos destas três canais, a partir de um filme de lapso de tempo típico (Secção 6). Os fagos individuais (pontos verdes) são claramente visíveis no espaço de tempo inicial (Figura 7A). Tipicamente, um númeroOs fagos são vistas de na superfície da célula (presumivelmente infectar essas células) ao passo que outros são os fagos não adsorvido, como mostrado na Figura 7B (painel da esquerda). O resultado da infecção se torna perceptível ao longo do tempo. O ciclo lítico é indicada pela produção intracelular de fagos novos (verde, Figura 7C), seguido de lise celular (células explodidas com fagos libertados verdes, a Figura 7D). Lisogenia é indicada pela produção de mCherry do promotor P RE (vermelho, Figura 7C) e a retoma do crescimento e divisão celular (vermelho, Figura 7D). Figura 1. </strong> gráfico de fluxo que descreve a criação de fagos fluorescentes. Um ligado fágico bruto é primeiro obtido por indução de um lisogénio do fago gpD-EYFP, abrigando um plasmídeo que expressa a proteína do tipo selvagem gpD (painéis AB). O fago é purificado através de uma série de passos (CL painéis). Figura 2. Placas fágicas. Placas do fago fluorescente (esquerda) são menores do que os do tipo selvagem (direita) após a incubação as placas durante 12 horas a 37 ° C. Figura 3. Bandas de fagos após ultracentrifugação. D) As duas bandas são visíveis após ultracentrifugação em gradiente de CsCl passo. A de cima corresponde a fragmentos de células e de fagos cápsides vazias, a banda inferior contém o fago desejado. Esquerda: fago fluorescente, a direita:. Selvagem B ) A banda do fago único é visível após ultracentrifugação em gradiente de equilíbrio de CsCl. A banda do fago fluorescente (à esquerda) é esverdeado, em comparação com uma banda azulado para fagos do tipo selvagem (direita). Figura 4. O procedimento de preparação de placas de gel de agarose. Figura 5. Imagens fluorescentes de fagos após coloração com DAPI. Fagos individuais são facilmente distinguíveis, e YFP e DAPI sinais co-localizar muito bem. Figura 6. Descrição esquemática de infecções de fagos e configuração de imagem. Clique aqui para ver uma versão em tamanho dessa imagem. gura 7 "src =" files/ftp_upload/3363/3363fig7.jpg / "/> Figura 7. Imagens típicas de um filme de lapso de tempo de infecção do fago. São mostrados o contraste de fase, YFP e canais mCherry, bem como uma sobreposição dos três canais. (A) YFP canais imagens do prazo inicial. Esquerda, a soma das imagens YFP em diferentes posições z-. As três imagens direita são exemplos de imagens YFP em diferentes posições z-, correspondentes a diferentes áreas da superfície da célula. (B), (C) e (D) imagens sobrepostos (esquerda) da de contraste de fase (meia-esquerda), YFP (meio-direita) e mCherry (direita) canais em diferentes intervalos de tempo. (B) Em t = 0, duas células são vistos, cada infectadas por um fago único (pontos verdes), e uma célula é infectada por três fagos. Também observou que alguns fagos não adsorvido. (C) Em t = 80 min, as duas células infectadas por fagos individuais têm cada um ido para a via lítica, como indicamd pela produção intracelular de fagos novos (verde). A célula infectada por três fagos passou para a via lítica, como indicado pela produção de mCherry do promotor PRE (vermelho). (D) Em t = 2 horas, a via lítica resultou em lise das células (célula explodida), enquanto que a célula lisogénica dividiu §. § painéis esquerdo da Figura 7 (C) e (D) são reproduzidos a partir de celular, 141, Lanying Zeng, Samuel O. Skinner, Chenghang Zong, Jean Sippy, Michael Feiss, e Ido Golding, tomada de decisão em um nível subcelular determina o resultado de Infecção Bacteriófago, 682-691, Copyright (2010), com a permissão da Elsevier. Coe nome Genótipo relevante Fonte / referência Cepas bacterianas LE392 cearF John Cronan, da Universidade de Illinois Cepas fago λ LZ1 GPD-EYFP, cl857 SAM7 D-eyfp b :: kanR Zeng et al. 5 λ LZ2 gpD mosaico genótipo, mesmo que λ LZ1 Zeng et al. 5 Plasmídeos pP RE – mCherry mCherry sob o controlo de P RE, amp R Zeng et al. 5 pPLate * D gpD sob o controlo do promotor tardio λ, amp R Zeng et al. 5 Tabela 1. Estirpes bacterianas,fagos e plasmídeos usados ​​neste trabalho. Ρ Densidade (g / ml) CsCl (g) SM (ml) Índice de refração η 1,30 39 86 1,3625 1,50 67 82 1,3815 1,70 95 75 1,3990 Tabela 3. Soluções de CsCl preparado em tampão SM (100 ml) por passos de gradientes.