組換えアデノ随伴ウイルスベクターの産生と力価測定

次のプロトコルをまとめた図は、図1を参照してください。 安全上の注意：組み立てられたウイルス粒子と接触しているすべての材料はVirkon液または他の適切な消毒剤で消毒する必要がある。 1。プラスミドDNAの株式の準備（〜2日間） 以下のプラスミドが1必要です。 pRV1 – AAV2 repおよびcap配列を含有する PH21 – AAV1 repおよびcap配列を含有する pFdelta6 – アデノウイルスヘルパープラスミド AAV2パッケージングシグナル（逆方向末端反復、ITRS）に挟まれた組換え発現カセットを含むプラスミドAAV pFdelta6が部分欠失を防ぐためにStbl2コンピテントセルで成長させる必要がありますが、pRV1とPH21はDH5alphaコンピテントセルに成長させることができる。部分的な削除がDH5alpha細胞内で発生した場合はAAVプラスミドはStbl2細胞に成長させることができる。 プラスミドDNAは高品質とRNAの汚染物質の自由でなければならない。プラスミドは、次のダイジェストを使用して整合性をスクリーニングすることができます。 pRV1 – XbaIで消化7.5キロバイトと3.8 kbのバンドを与えるために PH21 – 4.5kbのバンドを与えるためにEcoRIで消化、2.8 kbと0.2キロバイト pFdelta6 – 5.5kbのバンドを与えるためにHindIIIでダイジェスト、3 KB、3 KB、2.3 kbと1.5キロバイト 2。 （ – 3日間2）トランスフェクションのためのヒト胚性腎臓293（HEK293）細胞の調製プレート2個の80％5 15cmの直径Nunc社製組織培養皿にHEK293細胞のコンフルエント150センチメートル2フラスコ。トランスフェクションの前にコンフルエント80％（めっき後約48時間） – 細胞は70でなければなりません。 10％ウシ胎児血清、100 U / mlのペニシリン/ 100μg/ mlのストレプトマイシンを含む低グルコースと標準ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で培養細胞。 トランスフェクションの前に3時間は、DMEMを除去し、イスコフと交換の5％ウシ胎児血清を含む改変ダルベッコ培地（IMDM）。 3。ウイルス性プラスミドのトランスフェクション（トランスフェクションのための〜1時間、インキュベーションのための3日間） ウイルスの単一のバッチ（5 × 15cmの組織培養プレート）のために、以下を準備します。 プラスミド62.5μgのAAV 125μgのpFdelta6 31.25μgのpRV1 31.25μgのPH21 1650μlの2.5 M CaCl 2を 12ミリリットルのdH 2 O 50 mlチューブにクラス2の組織培養フード滅菌フィルタートランスフェクション混合物に。 ソリューションをボルテックスながら、素早く液（pH 7.05）緩衝生理食塩水2 × HEPES 13 mlを加える。 50 mlチューブの蓋を交換し、15秒間ボルテックスし続けます。 1分45秒放置する、微細な白色沈殿物が形成すべきである。 静かに各15cmの組織培養皿へのトランスフェクション溶液5mlを加える。スワールプレートが混在し、インキュベーターに戻ります。 トランスフェクション後16時間は、IMD​​M培地を除去し、DMEMで置き換えてください。 4。細胞の溶解とrAAVsの収穫（2時間） トランスフェクション後72時間は、細胞培養プレートから培地を除去し捨てる。すべての廃棄物は、Virkon液または他の適切な消毒剤で処理する必要があります。 ゆっくりと（; pH7.4のPBS）緩衝生理食塩水暖かい1 ×リン酸で細胞を洗浄。 各プレートに25ミリリットル温かいPBSを加え、穏やかにセルスクレーパーで細胞を取り除く。 50mlチューブ中で懸濁液を集める。 10分800 xgで細胞をペレット化する。 上清と150mMのNaClでペレットを再懸濁します、20mMのトリスpH8.0を破棄し、組織培養プレートあたり10mlを使用してください。 2つの50 mlチューブに分割。 のdH 2 Oで10％のデオキシコール酸ナトリウムの新鮮な溶液を調製します最終濃度0.5％のために各チューブには、この1.25 mlを加え。 ml当たり50単位の最終濃度にベンゾナーゼヌクレアーゼを追加。徹底的にチューブを混ぜる。 <l私は37>インキュベーション℃で1時間。 15分間3000 × gで遠心分離によって細胞残屑を取り除きます。新鮮な50 mlチューブに移す、すべての細胞の破片がヘパリンカラム（ステップ5を参照）がブロックされないように削除されていることを確認してください。この段階で、サンプルは、続行する前に-20℃で保存することができます。我々は、感染性を低下させることなく-20℃で数週間サンプルを保存している。 5。 rAAVsのヘパリンカラム精製（2 – 3時間） そのソリューションが流れそう〜5.4ステップ5.2の毎分1 mlのカラムを通して蠕動ポンプを使用してセットアップハイトラップのヘパリンカラム。に気泡がヘパリンカラムに導入されていないことを確認することが重要です。 10ミリリットル150mMのNaCl、20mMトリス、pH8.0でカラムを平衡化する。 カラムを50 mlのウイルス液を適用するとを通して流れるようになります。 20ミリリットル100mMのNaCl、20mMトリス、pH8.0でカラムを洗浄。 5 mlのシリンジを使用すると、列wを洗浄し続けます1ミリリットル300mMのNaCl、20mMトリス、pH8.0のに続いてi番目の1ミリリットル200mMのNaCl、20mMのトリス、pH8.0、。フロースルーを捨てる。 適用することにより、カラムから5mlの注射器と穏やかな圧力の溶出ウイルスを使用する： 1.5ミリリットル400mMのNaCl、20mMのトリス、pH8.0の 3.0ミリリットル450 mMのNaCl、20mMトリス、pH8.0の 1.5ミリリットル500mMのNaCl、20mMトリス、pH8.0の 15 ml遠心チューブに、これらを収集する。 6。濃度とrAAVsの無菌濾過（1時間） 10万分子量カットオフを持つアミコンウルトラ-4遠心フィルターユニットを使用してベクトルを集中する。 2分（室温で）2000 xgでコンセントレータと遠心分離機にカラム溶出液4mlをロードする。ろ過液を廃棄し、残りのウイルス液と繰り返し遠心分離でコンセントレータをリロードします。濃縮された量は約250μlのはずです。濃縮されたボリュームがこれよりかなり多い場合は、フローのtを捨てるhroughと体積が約250μlのようになるまで1分のステップで遠心し続けます。 500μlの最終容量のためにウイルスをPBS 250μlを加え、コンセントレータから取り外します。 13mmの直径0.2μmのシリンジフィルターを通してフィルターベクトル。必要になるまでベクトルを分注し、-80℃で保存してください。 7。ウイルスストックのタイター（3日） これは、レポーター遺伝子または免疫細胞化学的に検出可能な遺伝子産物を駆動するHEK293細胞において活性であるプロモーターが必要です。 HEK293細胞他の細胞株または初代細胞培養と互換性のないベクトルを生成するときに使用することができます。 そう彼らが40であることをHEK293細胞を播種が18ポリ- L -リジンコートしたガラス製カバースリップまたはヌンクチャンバースライドの18の井戸を準備 – コンフルエント50％。 Creリコンビナーゼ依存rAAVsの滴定のためにその安定的に発現するCreリコンビナーゼ2 HEK293細胞を使用してください。 シリアルDの各ウェルに感染AAVベクター（図2A）のilutions。希釈当たり3ウェルを使用してください。我々は日常的に各ウェルに直接ウイルスを追加。 後72時間は、室温で10分のために培地（2％PFAの最終濃度を与える）に4％パラホルムアルデヒド（PFA）の等量を追加することで、HEK293細胞を修正。 細胞をPBSで3回洗浄し、のdH 2 Oおよびカバースリップですすいでください。 最高希釈係数を持つ3つの井戸から、形質導入された細胞の数を数えるが、それでも、感染した細胞が含まれ、これらの平均値を見つけ、マイクロリットルあたりの感染ユニット（図2B）の番号を与えるために希釈係数を掛けます。 8。予想結果 HEK293細胞は、強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）を図2Bに示されているウイルスのエンコーディングで形質導入。我々は一般的にマイクロリットルあたり約6 × 10 6感染性粒子の一貫した力価を実現。我々は日常的に定位麟蹄のため、これらのベクターを使用成人の齧歯類の脳にction。これは、地域固有の遺伝子発現2の強力な技術を提供します。細胞型の選択的な遺伝子発現を持つこの地域の特異性を組み合わせるために、我々は、Cre -トランスジェニックマウス2のターゲット領域にCreリコンビナーゼ依存rAAVsを注入する。図2C – Eは、成人のパルブアルブミンのCreトランスジェニックマウス3の異なる脳領域にEGFPをエンコードするのCre依存rAAVsの定位注射の例を示します。 図1。するrAAVの生産のためのプロトコルの模式図。 1）HEK293細胞を播種し、70までに成長している – 80％コンフルエントに。 2）AAVとヘルパープラスミドを調製し、そしてHEK293細胞にトランスフェクトされています。トランスフェクションおよびHEK293細胞は別の56時間培養した後、3）培地は、DMEM、16時間に変更されます。 4）HEK293細胞を回収し、溶解されています。 rAAVベクターはcによって細胞残渣から分離されていますentrifugation。 5）ウイルス粒子が濃縮し、滅菌前にヘパリンカラムを通して精製されています。 6）HEK293細胞を24ウェルプレート上で増殖し、感染単位の数を決定するAAVベクターの連続希釈液で感染されています。 図2。タイターとrAAV1 / 2のin vivoアプリケーションで。ウイルス力価を測定するためのHEK293細胞の（A）のセットアップ。 HEK293細胞は、rAAVsの連続希釈液で形質導入されています。 C、感染していないコントロール、N、未希釈のウイルスストックを1μl。 （B）HEK293細胞はEGFPを発現するrAAVsに感染している。 （CE）ウイルスeGFPの発現は、Creを活性化rAAVsの定位注射後のパルブアルブミンのCreトランスジェニックマウスの別のターゲット地域でCreを発現神経細胞に限定されています。例の画像は（C）網様体視床と淡蒼球、（D）歯状回と海馬の（E）CA1領域におけるGFP免疫反応性を示しています。 DG、ドntate回、RT、視床網様核、GP、淡蒼球。スケールバー：B、500μmであり、C、100μm以下、D、100μm以下、E、500μmである。