पुनः संयोजक एडिनो – जुड़े वायरस वैक्टर (rAAVs) तेजी से मूल्यवान होते जा रहे हैं<em> Vivo में</em> पशुओं में अध्ययन. हम वर्णन कैसे rAAVs प्रयोगशाला में उत्पादित किया जा सकता है और कैसे इन वैक्टर संक्रामक कणों की संख्या का एक सटीक पढ़ने देना titered किया जा सकता है.
हाल के वर्षों में पुनः संयोजक एडिनो – जुड़े वायरल vectors (AAV) पशुओं में vivo अध्ययन में के लिए तेजी से मूल्यवान बन गए हैं, और वर्तमान में भी मानव नैदानिक परीक्षणों में परीक्षण किया जा रहा है . जंगली – प्रकार AAV parvoviridae परिवार के एक सदस्य गैर रोगजनक और प्रतिकृति की कमी स्वाभाविक है. व्यापक पारगमन प्रोफ़ाइल, कम प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मजबूत और लगातार transgene ये वैक्टर के साथ हासिल की अभिव्यक्ति के लिए इन विट्रो में और vivo में जीन वितरण में उन्हें एक लोकप्रिय और बहुमुखी उपकरण बना दिया है. rAAVs आसानी से और सस्ते प्रयोगशाला में उत्पादित और उनके अनुकूल सुरक्षा प्रोफाइल के आधार पर किया जा सकता है, आम तौर पर एक कम सुरक्षा वर्गीकरण दिया जाता है. यहाँ, हम और दोनों AAV1 और AAV2 के capsid प्रोटीन युक्त chimeric rAAVs के उत्पादन titering लिए एक विधि का वर्णन. इन तथाकथित chimeric वैक्टर के उपयोग के उच्च titres (AAV1) शेयरों और शुद्धि के रूप में दोनों माता पिता सीरमप्रकारों के लाभों को जोड़ती हैआत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (AAV2) के द्वारा. ये AAV सीरमप्रकारों सभी AAV सीरमप्रकारों के अध्ययन का सबसे अच्छा कर रहे हैं, और व्यक्तिगत रूप से एक व्यापक संक्रामकता पैटर्न है. यहाँ वर्णित chimeric वैक्टर AAV1 और AAV2 के संक्रामक गुण है और इस प्रकार न्यूरॉन्स, कंकाल की मांसपेशी, अग्न्याशय, दूसरों के बीच में गुर्दे सहित, ऊतकों की एक बड़ी रेंज को संक्रमित उम्मीद की जा सकती चाहिए. विधि यहाँ वर्णित हेपरिन स्तंभ शुद्धि का उपयोग करता है, एक विधि के लिए एक उच्च वायरल और एक सीज़ियम क्लोराइड ढाल के माध्यम से centrifugation के रूप में अन्य शुद्धि विधियों, की तुलना में क्लीनर वायरल तैयारी अनुमापांक दे माना जाता है. इसके अतिरिक्त, हम वर्णन कैसे इन वैक्टर जल्दी और आसानी से हो सकता है संक्रामक कणों की संख्या का सटीक पढ़ने देना titered कर सकते हैं.
rAAV वैक्टर पशुओं में vivo अध्ययन में तेजी के लिए मूल्यवान होते जा रहे हैं. यहाँ, हम उत्पादन rAAVs के लिए एक सरल और सस्ती प्रोटोकॉल का वर्णन किया है, जो कंपनियों को वायरस उत्पादन का महंगा आउटसोर्सिंग से बचने के द्वारा इस उपयोगी वेक्टर के व्यापक आवेदन की सुविधा हो सकती है. प्रोटोकॉल (1 संदर्भ पर आधारित) chimeric rAAV1 / 2 बराबर चार के अनुपात में दोनों माता पिता सीरमप्रकारों से capsid प्रोटीन युक्त वैक्टर के उत्पादन का वर्णन करता है. हेपरिन स्तंभों के लिए बाध्य द्वारा rAAV वैक्टर की शुद्धि AAV2 capsid प्रोटीन की अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है, लेकिन AAV1 की तुलना में अन्य सीरमप्रकारों यहाँ उल्लिखित के साथ संयुक्त किया जा सकता है है. इसके अतिरिक्त, AAV6 हेपरिन करने के लिए बाध्य सूचित किया गया है, हालांकि एक कम आत्मीयता के साथ, और संभावित हेपरिन इस 5,6 प्रक्रिया का उपयोग कर स्तंभों के साथ शुद्ध किया जा सकता है है. लेकिन यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अन्य सीरमप्रकारों हेपरिन स्तंभ क्षालन 5,7 के लिए NaCl के विभिन्न सांद्रता की आवश्यकता होगी .
पैकेजिंग rAAV जीनोम 4.1 और 4.9 केबी के बीच पैकेजिंग दक्षता में एक तेज 5.2 8 केबी कमी के साथ इष्टतम हो दिखाया गया था. यह पैकेजिंग सीमा rAAV प्रणाली का सबसे बड़ा नुकसान माना जा सकता है, क्योंकि transgene अभिव्यक्ति की सेल प्रकार विशिष्ट विनियमन आम तौर पर बड़े सीआईएस अभिनय तत्व है जो छोटे AAV कणों के भीतर नहीं ठहराया जा सकता द्वारा हासिल की है. पैकेज जीन है कि AAV पैकिंग सीमा हम अलग वायरल एक 500 μl बैच में 250 μl केंद्रित बैचों के संयोजन कर रहे हैं पीबीएस जोड़ने के रूप में 6.3 चरण में उल्लिखित के बजाय, बंद कर रहे हैं करने का प्रयास करने से उत्पन्न उन के रूप में कम अनुमापांक बैचों, पर काबू पाने के लिए. विश्वसनीय सेल प्रकार विशिष्ट पारगमन संयोजन Cre ड्राइवर चूहों और सशर्त rAAV (नीचे देखें) कैसेट पैकेजिंग सीमा खींच से बचने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.
ध्यान से, जबकि इस प्रोटोकॉल उच्च टी के उत्पादन पर आसान करने के लिए निर्देशों का पालन करें प्रदान करने का प्रयासआईटीईआर rAAV, यह हेपरिन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्धि के लिए AAV2 capsid प्रोटीन moieties की उपस्थिति की आवश्यकता है. की तुलना में अन्य सीरमप्रकारों AAV2 वैकल्पिक प्रक्रियाओं 9 का उपयोग कर शुद्ध किया जाना चाहिए. हेपरिन स्तंभ शुद्धि का एक लाभ यह है यह AAV वैक्टर है कि अधिक से अधिक उत्पादित उन सीज़ियम क्लोराइड 10 ढाल का उपयोग की तुलना में संक्रामकता दर का उत्पादन माना जाता है. हालांकि, वहाँ भी इस विधि को कुछ कमियां हैं. उदाहरण के लिए, अन्य प्रोटीन है कि हेपरिन बाँध भी शुद्ध वायरल स्टॉक में मौजूद हो सकता है. जबकि हेपरिन शुद्ध वैक्टर tropism वेक्टर 10 अनुमापांक, विशेष रूप से उत्तेजक या तो 20 या निरोधात्मक न्यूरॉन्स (छवि 2) लक्ष्य हमारे दृष्टिकोण से प्रभावित किया जा सकता है है Cre प्रेरित AAV मध्यस्थता transgene अभिव्यक्ति के सक्रियण रोजगार और अनुमापांक स्वतंत्र है . हेपरिन स्तंभ शुद्धि के लिए एक वैकल्पिक एक iodixanol घनत्व ढाल है, जो एक उच्च वायरल अनुमापांक और के उपयोग की तुलना में purer तैयारी उत्पादन का उपयोगएक सीज़ियम क्लोराइड 10 ढाल. इस विधि भी हेपरिन स्तंभ शुद्धि के साथ जोड़ा जा सकता है के लिए एक वेक्टर है कि 99% शुद्ध 11 से अधिक है का उत्पादन. इसलिए सावधानी से विचार करने के लिए अलग – अलग समूहों द्वारा जो वायरल शुद्धि विधि उनके विशेष बहाव के आवेदन के लिए सबसे अच्छा है के रूप में लिया जाना चाहिए.
सबसे आम समस्या इस प्रोटोकॉल के साथ जुड़े कम वायरल अनुमापांक है. हमारे अनुभव में यह आम तौर पर कम अभिकर्मक दक्षता, या हेपरिन स्तंभों से वायरस के क्षालन पता लगाया जा सकता है. सभी अभिकर्मक सामग्री अभिकर्मक से पहले कमरे के तापमान पर हो सकता है, करना चाहिए और परीक्षण transfections प्रत्येक प्रयोगशाला में इष्टतम स्थितियों खोजने के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए. अभिकर्मक के अन्य तरीकों, lipofectamine जैसे, अत्यधिक कुशल हैं, लेकिन बेहद महंगा हो सकता है. इसके अतिरिक्त, एकाग्रता और हेपरिन स्तंभ क्षालन समाधान के पीएच हेपरिन स्तंभों witho से virions की पूरी क्षालन के लिए महत्वपूर्ण हैut नुकसान. एक अन्य महत्वपूर्ण मुद्दा यह है कि पैकेजिंग की कोशिकाओं को अच्छी तरह से टिशू कल्चर व्यंजन की सतह का पालन करना होगा. यदि कोशिकाओं की प्रक्रिया के दौरान कुछ स्तर पर अलग प्रयोग और कोशिकाओं की नई शीशी defrost समाप्त करने की सलाह दी है.
कृन्तकों में transgene अभिव्यक्ति की spatio-अस्थायी नियंत्रण आसानी से सटीक संरचनात्मक लक्ष्यीकरण और जानवर के विकास मंच द्वारा हासिल की है. कुशल AAV की मध्यस्थता जीन हस्तांतरण 12,13 utero में दिखाया गया है. वयस्क दिमाग में, stereotaxic इंजेक्शन के बाद rAAV कणों के साथ संक्रमित क्षेत्र बहुत छोटे से बहुत बड़े क्षेत्रों को लक्षित न केवल वायरल अनुमापांक में परिवर्तन द्वारा भी लेकिन इंजेक्शन पैरामीटर बदलकर क्षेत्रों से समायोजित किया जा सकता है. ये मात्रा और इंजेक्शन की गति और वायरस के निलंबन के साथ 14 polyol mannitol का समावेश शामिल हैं . Mannitol भी प्रणालीगत rAAV 15 इंजेक्शन के बाद ऊतकों की एक किस्म के संक्रमण को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है </> समर्थन.
rAAV (4.7 लगभग केबी) की पैकेजिंग क्षमता शायद जीन है कि इन वायरल vectors से व्यक्त किया जा सकता है के मामले में सबसे सीमित कारक है. हालांकि, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि यह आंशिक रूप से अलग rAAV वैक्टर में किया जा सकता है बड़ा बंटवारे जीन या अभिव्यक्ति कैसेट से दूर और एक ब्रिजिंग अनुक्रम शुरू करने, जीन अभिव्यक्ति की शुरुआत जब virions वही 16 कोशिका को संक्रमित. RAAV वैक्टर द्वारा किए गए जीन की अभिव्यक्ति के स्तर भी बहुत आत्म – मानार्थ rAAV वैक्टर 17 का उपयोग करके बढ़ाया जा सकता है है. RAAV वैक्टर Stereotaxic इंजेक्शन एक तेजी से, एक क्षेत्र विशेष तरीके में जीन की अभिव्यक्ति उत्प्रेरण के लिए सस्ती और शक्तिशाली तरीका प्रदान करता है. 2 एन डी पीढ़ी शाही सेना हस्तक्षेप रणनीतियों के साथ संयोजन में 18 rAAVs भी क्षेत्र – विशिष्ट जीन दस्तक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सर्किट और सेल प्रकार प्राप्त करने के rAAVs Cre ट्रांसजेनिक चूहों या सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटरों के साथ संयुक्त किया जा सकता है हैविशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति, उच्च स्थानिक संकल्प 2,19-21 के साथ आनुवंशिक जोड़तोड़ की अनुमति, जबकि जैसे tet प्रणाली के साथ फिटिंग rAAVs वायरस की मध्यस्थता जीन अभिव्यक्ति 22,23 से अधिक अस्थायी नियंत्रण कहते हैं. इन उदाहरणों इन वैक्टर भारी मिश्रित संभावित वर्णन और rAAV आधारित अध्ययन में आने वाले वर्षों में एक तेजी से वृद्धि की भविष्यवाणी.
The authors have nothing to disclose.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Amicon Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
Dulbeco’s modified Eagle medium (DMEM) | Invitrogen | 10567014 | Supplement with 10% FCS and 10 units/ml penicillin/100 μg/ml streptomycin |
Hek293 cells | American type culture collection | CRL-1573 | Use at passage less than 30 |
HEPES buffered saline | Sigma-Aldrich | 51558 | |
HiTrap Heparin cartridge | Sigma-Aldrich | 54836 | |
Iscove’s modified Dulbecco’s medium | Invitrogen | 12440-053 | Supplement with 5% FCS |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
15 cm Tissue culture dishes | Fisher Scientific | 157150 | |
Stbl2 competent cells | Invitrogen | 10268-019 | |
Virkon solution | Fisher Scientific | NC9821357 | Leave to disinfect overnight before discarding to drain |
Table 1. Specific reagents required for protocol