重组腺相关病毒载体的生产和滴定
Summary
重组腺相关病毒（rAAVs）载体正变得越来越有价值的<em>在体内</em在动物身上的实验。我们描述了如何rAAVs可以在实验室中产生，并如何将这些载体可以被滴定给一个准确的读数产生的传染性颗粒数量。
Abstract
近年来的重组腺相关病毒载体（AAV）已成为越来越有价值的， 在动物体内研究，而目前也正在测试在人体临床试验。野生型腺相关病毒是一个非致病的细小病毒家族成员固有的复制缺陷。广泛传导，低免疫反应，以及与这些载体实现的强大和持久的转基因表达，使他们为流行和通用的工具 ， 在体外和体内基因传递。 rAAVs可以轻松，廉价地在实验室中产生的，基于其良好的安全性，一般都是低安全分类。在这里，我们描述了一个含有AAV1和AAV2衣壳蛋白嵌合rAAVs的生产和滴定的方法。使用这些所谓的嵌合载体，结合双方父母的血清型，如高滴度的股票（AAV1）和净化的好处通过亲和层析（AAV2）。这些腺相关病毒血清型是最好的腺相关病毒血清型研究，及个别有广泛的传染性格局。这里所描述的嵌合载体应该有AAV1和AAV2传染病属性，因此可以预计大范围的组织，包括神经细胞，骨骼肌，胰腺，肾等等的感染。这里介绍的方法使用肝素柱纯化，方法认为给予较高的病毒滴度和病毒编制比其他净化方法，如通过氯化铯梯度离心，清洁。此外，我们描述了如何将这些载体可以快速，轻松地滴度，以提供准确的读数产生的传染性颗粒数量。
Protocol
Discussion
重组AAV载体在动物体内研究越来越有价值。在这里，我们生产rAAVs一个简单而廉价的的协议，可能有助于避免病毒的生产成本高昂的外包公司的广泛应用这项有益的载体。协议（基于参考文献1）描述生产嵌合rAAV1 / 2，其中包含从4等于比率在双方父母的血清型衣壳蛋白的载体。通过肝素列结合的rAAV载体净化依靠AAV2衣壳蛋白的表达，但可以用比AAV1这里列出的血清型相结合。此外，AAV6还报道肝素结合，虽然减少的亲和力，并可能与使用肝素这个过程 5,6列纯化。但是应该指出，其他血清型会要求不同浓度的NaCl，肝素柱洗脱5,7 。
包装的rAAV基因组显示在包装效率大幅减少到8 KB 5.2 4.1和4.9 kb的之间最佳。这种包装限制，可以考虑的rAAV系统的最大缺点，因为细胞类型特异性的转基因表达的调节通常是由大顺行事，不能住小腺相关病毒颗粒内的元素实现。为了克服低滴度批次，如那些试图包密切AAV的包装限制，我们结合加入PBS 6.3步，而不是单独的病毒批次，集中到一个首批500μL到250μL的基因是导致。相结合，创建驱动小鼠和有条件的rAAV盒（见下文），以避免拉伸包装限制，可以实现可靠的细胞类型的具体传导。
值得注意的是，虽然此协议试图提供易于遵循的指示，生产高T国际热核实验堆的rAAV，它要求肝素亲和层析的纯化AAV2为核衣壳蛋白基团的存在。使用替代程序9血清型比AAV2必须净化。肝素柱纯化的一个好处是，它被认为是产生有传染性率大于生产的使用氯化铯梯度10的AAV载体。然而，这种方法也存在着一些弊端。例如，结合肝素的其他蛋白质也可能是目前在纯化病毒的股票。虽然可以通过载体滴度10，我们的方法，具体目标无论是20兴奋性或抑制性神经元（图2）的影响肝素纯化载体嗜采用诱导Cre重组AAV介导的转基因表达的激活和滴度独立。肝素柱纯化的另一种方法是使用碘克沙醇密度梯度，从而产生较高的病毒滴度比使用素净准备氯化铯梯度10。这种方法也可以结合肝素柱纯化，以产生一种载体，是大于99％的纯 11 。因此，需要认真考虑采取个别团体病毒提纯方法最适合其特定的下游应用。
与此协议相关的最常见的问题是低的病毒滴度。这在我们的经验，通常可以追溯到转染效率低，或病毒从肝素列洗脱。转染前，所有转材料，应在室温下进行测试转染应在每个实验室中找到最佳的条件。其他转染方法，脂质体等，是一种高效的，但可以非常昂贵。此外，肝素柱洗脱解决方案的浓度和pH值是完整的病毒粒子洗脱witho肝素列的关键UT损害。另外很重要的一点是，包装细胞，必须坚持以组织培养皿的表面。如果在某个阶段的细胞分离，在手术过程中，建议终止实验和除霜一个新的细胞小瓶。
在啮齿类动物中的转基因表达的时空控制很容易实现准确的解剖定位和发育阶段的动物。高效的腺相关病毒介导的基因转移已被证明在子宫内12,13。在成人大脑，立体定向注射后的rAAV颗粒感染的地区，可以从非常小的有针对性的地区，不仅在病毒滴度的变化，但也到更大的领域，通过改变注入参数进行调整。这些措施包括注射量和速度，列入多元醇与病毒悬液14甘露醇。甘露醇也可用于增强全身的rAAV注射15后的各种组织感染 </ SUP>。
rAAV的包装容量（约4.7 KB）可能是在可以从这些病毒载体基因表达方面，最重要的限制因素。然而，最近的研究表明，这可以部分克服分裂更大的基因或表达盒的rAAV载体为单独的和引进架桥序列，启动基因表达的病毒粒子感染同一个细胞 16时。的rAAV载体携带的基因表达水平，也可以大大提高使用自免费的rAAV 载体 17 。立体定向注射rAAV的载体诱导在一个特定区域的的方式的基因表达提供了一种快速，廉价和功能强大的方法。 18 rAAVs结合第二代RNA干扰策略也可以用于特定区域的基因击倒。 rAAVs可以结合的Cre转基因小鼠或细胞类型特异性启动子，以实现电路和单元式特定基因的表达，允许高空间分辨率2,19-21的遗传操作，而装修rAAVs如TET系统增加了对病毒介导的基因表达22,23的时间控制。这些例子说明这些向量组合巨大潜力，预测在今后几年中的rAAV为基础的研究的快速增长。
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Amicon Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Dulbeco’s modified Eagle medium (DMEM) | Invitrogen | 10567014 | Supplement with 10% FCS and 10 units/ml penicillin/100 μg/ml streptomycin |
| Hek293 cells | American type culture collection | CRL-1573 | Use at passage less than 30 |
| HEPES buffered saline | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| HiTrap Heparin cartridge | Sigma-Aldrich | 54836 | |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium | Invitrogen | 12440-053 | Supplement with 5% FCS |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| 15 cm Tissue culture dishes | Fisher Scientific | 157150 | |
| Stbl2 competent cells | Invitrogen | 10268-019 | |
| Virkon solution | Fisher Scientific | NC9821357 | Leave to disinfect overnight before discarding to drain |
Table 1. Specific reagents required for protocol
Referências
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