Summary

Patch-clamp Misure di capacità e Ca 2 + Imaging terminazioni nervose della retina singola in Fette

Published: January 19, 2012
doi:

Summary

Qui descriviamo un protocollo per la preparazione di agar-embedded fette della retina che sono adatti per elettrofisiologia e Ca2 + imaging. Questo metodo permette di studiare nastro di tipo sinapsi in microcircuiti della retina mediante diretta patch-clamp registrazioni dei singoli terminali nervosi presinaptici.

Abstract

Stimoli visivi vengono rilevati e inoltrato su una ampia gamma dinamica di intensità di luce e variazioni di frequenza dai neuroni specializzati nella retina dei vertebrati. Due classi di neuroni della retina, fotorecettori e cellule bipolari, ottenere questo risultato utilizzando zone attive nastro tipo, che consentono il rilascio dei neurotrasmettitori sostenuta e high-throughput per periodi di tempo lunghi. ON-cellula bipolare di tipo misto (Mb) terminali nella retina pesci rossi, che depolarizzare agli stimoli luminosi e ricevere asta mista e di ingresso dei fotorecettori cono, sono adatti per lo studio delle sinapsi, sia a causa delle loro grandi dimensioni nastro di tipo (~ 10-12 micron di diametro) e per le loro numerose connessioni laterali e reciproca sinaptica con dendriti delle cellule amacrine. Accesso diretto ai terminali Mb cellule bipolari a fette pesci rossi della retina con la patch-clamp consente la misurazione di Ca 2 + presinaptico correnti, variazioni di capacità della membrana, e reciproca inibizione di feedback sinaptica mediata dal GABA <sub> recettori GABA A e C espresso sui terminali. Presinaptico misure membrana capacità di esocitosi permettono di studiare a breve termine plasticità del rilascio di neurotrasmettitore eccitatorio 14,15. Inoltre, la plasticità a breve termine ea lungo termine del rilascio di neurotrasmettitore inibitorio da parte delle cellule amacrine possono anche essere indagato da registrazioni di inibizione reciproca di feedback che arrivano al terminal Mb 21. In brevi periodi di tempo (ad esempio ~ 10 s), GABAergici inibizione di feedback reciproco a partire da cellule amacrine subisce accoppiato impulsi depressione attraverso l'esaurimento GABA piscina vescicola 11. La dinamica sinaptica di microcircuiti retina nello strato plessiforme interno della retina può quindi essere direttamente studiato.

Il cervello-fetta tecnica è stata introdotta più di 40 anni fa ma è ancora molto utile per lo studio delle proprietà elettriche dei neuroni, sia a singola cellula soma, dendriti singolo o assone, e microcircuit livello sinaptico 19. Tessuti che sono troppo piccole per essere incollato direttamente sulla camera di taglio sono spesso incorporati in prima agar (o la collocazione in una carta da filtro) e poi a fette 20, 23, 18, ​​9. In questo video, ci avvaliamo di pre-embedding tecnica di agar con retina pesci rossi. Alcuni dei giganti terminali delle cellule bipolari nelle nostre fette di retina pesci rossi sono axotomized (assone-cut) durante la procedura di taglio. Questo ci permette di isolare singoli ingressi terminale nervoso presinaptico, perché la registrazione da terminali axotomized esclude i segnali dal soma-dendritiche vano. In alternativa, si può anche registrare da intatto Mb cellule bipolari, registrando dai terminali collegati a assoni che non sono stati tagliati durante la procedura di taglio. Nel complesso, l'uso di questo protocollo sperimentale sarà di aiuto negli studi di fisiologia sinaptica della retina, l'analisi funzionale microcircuito, e la trasmissione sinaptica di sinapsi nastro.

Protocol

1. Soluzioni interne ed esterne Preparare la soluzione per affettare (calcio) dalla soluzione madre 10x e aggiungere MgCl 2, CaCl 2 e D-glucosio tutti i giorni. La soluzione finale è costituito da 1x (in mm): 119 NaCl, 2.5 KCl, 3.2 MgCl2, 0,25 CaCl 2, 12 D-glucosio, 0,2 acido L-ascorbico, 12 HEPES. Impostare il pH a 7.4 (con NaOH), e regolare osmolarità di 260 mOsm (con H 2 O e la soluzione madre 10x). Pesare il 3% a bassa temperatura gelifica…

Discussion

Un passo importante e difficile nel nostro protocollo è il trasferimento del pezzo di retina nella soluzione di agar (protocollo 3.4). E 'necessario rimuovere con attenzione il vitreo e la soluzione fetta residua dal pezzo della retina e trasferirlo senza distorsioni o piegature. Per fare questo, usiamo una piccola spatola (21-401-25B, Fisherbrand) con una punta piegata a formare un angolo di 90 °, insieme con una pinza punta angolata (11251-35, Strumenti Scienza Fine), di posizionare la retina pe…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo il Dr. Fred Rieke per la sua spiegazione del tipo di agar-embedded preparazione fetta della retina quando abbiamo iniziato con il protocollo nel nostro laboratorio. Ringraziamo anche Lori Vaskalis per l'illustrazione del schematica panoramica e Drs. Veeramuthu Balakrishnan e Soyoun Cho per gli utili commenti sul testo e video. Questo lavoro è stato supportato da una NEI-NIH RO1 concessione, ed è stato anche parzialmente sostenuto da una ricerca Korea Foundation Grant finanziato dal governo coreano [KRF-2008-357-E00032].

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
Low gelling-temperature agar Sigma A0701 Agarose type VII-A
Patch pipette World Precision Instruments 1B150F-4 Thick-walled (1.5 mm outer diameter) borosilicate glass
Vertical puller Narishige PP830  
Dental wax Cavex    
Spring scissors Fine Science Tools 15003-08  
45° angled fine tip forceps Fine Science Tools 11251-35  
Razor blade Personna   Double-edged, cleaned with 70% ethanol and H2O
Cylindrical tube Fisherbrand 03-338-1B Polyethylene sample vials 2.5 ml
Hyaluronidase Sigma H6254  
Vibratome slicer Leica VT1000S or VT1200S  
Upright microscope Olympus BX51WI  
60x water-immersion objective Olympus LUMPlanFl NA 0.90
CCD camera Sony XC-75  
Camera controller Hamamatsu C2400  
Monitor Sony   13” black and white monitor
Syringe filter Nalgene   0.2 μm
Micromanipulator Sutter Instrument MPC-200  
Lock-in amplifier HEKA   EPC-9/10 amplifiers have software emulation
Spinning disk laser confocal microscope Yokogawa CSU-X1 Live cell imaging after patch clamp whole cell recording
Slidebook software Intelligent Imaging Instruments (3i)   Imaging data acquisition and analysis
Paraformaldehyde Sigma P6148  
Phosphate buffer solution GIBCO 70013  
Superfrost slide Fisher Scientific   Slide glass
Anti-fading agents Biomeda corp.    
Confocal laser-scanning microscope Carl Zeiss LSM 710 Imaging of fixed tissue
Spatula Fisherbrand 21-401-25B  
Manuel vertical slicer Narishige ST-20  
Oregon Green 488 BAPTA-1 Invitrogen O-6806 Ca2+ sensitive fluorescent dye
Alexa Fluor 555 Hydrazide Invitrogen A-20501MP Fluorescent dye

Referências

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Citar este artigo
Kim, M., Vickers, E., von Gersdorff, H. Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices. J. Vis. Exp. (59), e3345, doi:10.3791/3345 (2012).

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